【2.6.2】VarScan肿瘤体细胞突变检测

VarScan是一个java写的linux系统下进行肿瘤体细胞突变检测（calls SNV in somatic variants）的软件，可用于目标捕获（targeted），外显子（ exome）以及全基因组测序（whole-genome resequencing） 等多种测序数据。

一、简介

插一句：体细胞突变（somatic mutation）是指患者某些组织或者器官后天性地发生了体细胞变异，虽然它不会遗传给后代个体，却可以通过细胞分裂，遗传给子代细胞。体细胞突变对肿瘤的发生发展有关键性的作用，并且它也是制定肿瘤癌症靶向治疗措施的关键所在。

VARSCAN有3个功能，如下图：

比较常用的是肿瘤样本——正常样本配对somatic mutation模式。

二、安装说明

2.1. 安装

VarScan寄存在sourceforge网站[1]，可通过链接：https://sourceforge.net/projects/varscan/files/

下载java二进制文件：

wget --no-check-certificate https://nchc.dl.sourceforge.net/project/varscan/VarScan.v2.3.9.jar

这里我们指定–no-check-certificate 允许chc.dl.sourceforge.net的过期证书。

终端运行：

​# java -jar VarScan.jar           
VarScan v2.3
​
USAGE: java -jar VarScan.jar [COMMAND] [OPTIONS]
​
COMMANDS:
        pileup2snp              Identify SNPs from a pileup file
        pileup2indel            Identify indels a pileup file
        pileup2cns              Call consensus and variants from a pileup file
        mpileup2snp             Identify SNPs from an mpileup file
        mpileup2indel           Identify indels an mpileup file
        mpileup2cns             Call consensus and variants from an mpileup file
​
        somatic                 Call germline/somatic variants from tumor-normal pileups
        copynumber                      Determine relative tumor copy number from tumor-normal pileups
        readcounts              Obtain read counts for a list of variants from a pileup file
​
        filter                  Filter SNPs by coverage, frequency, p-value, etc.
        somaticFilter           Filter somatic variants for clusters/indels
        fpfilter                Apply the false-positive filter
​
        processSomatic          Isolate Germline/LOH/Somatic calls from output
        copyCaller              GC-adjust and process copy number changes from VarScan copynumber output
        compare                 Compare two lists of positions/variants
        limit                   Restrict pileup/snps/indels to ROI positions
​

​
安装成功。

2.2 软件运行前准备工作-pileup文件

VarScan需要准备正常样本，肿瘤样本pileup文件， 首先，使用samtools处理normal，tumor样本的bam文件，得到相应pileup文件。

运行命令：

samtools mpileup \
            -q 1 \
            -f $REFERENCE \
            ${NORMAL_BAM} \
            --output $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.normal.pileup
​
samtools mpileup \
            -q 1 \
            -f $REFERENCE \
            ${TUMOR_BAM} \
            --output $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.tumor.pileup

2.3 软件运行

运行

java -Xmx10g -jar /home/6oclock/bin/VarScan.v2.3.9.jar somatic \
        $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.normal.pileup \
        $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.tumor.pileup \
        $WORKDIR/tmp/$SAMPLE.$prefix.mut

输出文件：运行完会生成.snp和.indel文件，其中后缀为.snp的文件即为对应snv结果，.indel为indel结果。

三、实战

以NA12878样本的测序数据，具体来实践一下吧。

3.1 数据下载

下载肿瘤样本与配对的正常样本的测序bam数据：

# 网站站点
data_url=http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS
​
# 正常样本
wget ${data_url}/NA12878.WGS.chrM.BwaMem.sort.bam 
# 肿瘤样本
wget ${data_url}/hg19.NA12878.tumor_addsnv.WGS.chrM.BwaMem.bam

​ 下载比对需要的参考基因组数据及其索引文件：

​# 网站站点
data_url=http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/Reference/hg19.chrM.fasta_BwaMem_index
​
# 参考基因
wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta
​
# 索引
wget ${data_url}/hg19.chrM.dict
wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.amb 
wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.ann 
wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.bwt 
wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.pac 
wget ${data_url}/hg19.chrM.fasta.sa

3.2 准备pileup文件

使用samtools分别处理normal，tumor样本的bam文件，以生成相应pileup文件， shell运行：

# 处理正常样本
samtools mpileup \
        -q 1 \
        -f hg19.chrM.fasta \
        NA12878.WGS.chrM.BwaMem.sort.bam \
        --output NA12878.normal.pileup
​
# 处理肿瘤样本
samtools mpileup \
        -q 1 \
        -f hg19.chrM.fasta \
        hg19.NA12878.tumor_addsnv.WGS.chrM.BwaMem.bam \
        --output NA12878.tumor.pileup

​

3.3 运行命令

此处我们将程序运行的标准输出和标准错误都分别重定向到对应的log和err文件中了。一步式运行：

java -Xmx10g -jar VarScan.v2.3.9.jar somatic \
    NA12878.normal.pileup \
    NA12878.tumor.pileup \
    NA12878.tumor \
    1>ass.log \
    2>ass.err

3.4 输出结果

此处我们的测试案例数据做了截取，因此可以非常快速的跑完，具体的结果如下图所示，可以看到生成了NA12878.tumor.snp 和NA12878.tumor.indel文件。其中NA12878.tumor.snp 即为最终检测出的肿瘤SNV结果，结构如下所示：

输出结果中几个比较重要的列的解释：

• chrom ：染色体；
• position ：染色体坐标;
• ref ：参考基因该位点基因型。
• var ：变异位点的基因型;
• normal_gt：正常样本该位点基因型;
• tumor_gt：肿瘤样本该位点基因型;
• somatic_status : 该变异的类型，一般区分为Germline和Somatic ，如上图标红部分，即为一个体细胞突变（somatic mutation） 。

至此，VarScan的实战体验基本就结束了。

四、sixbox运行

此外，sixoclock官网[2]基于CWL (common workflow language) 对VarScan软件进行了封装，通过我们开发的sixbox 软件可以快速进行软件的运行。对sixbox不了解可以通过六点了官网[3]了解下。下面是具体的运行步骤如下。

下载cwl 源码

sixbox pull c6e4a52a-ecb4-470d-90c1-0d2fcbd42e09

运行sixbox cwls 可以看到下载成功：

下载数据
wget http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS/NA12878_addsnv.tumor.pileup
​
wget http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS/NA12878_addsnv.normal.pileup
​

参数配置

使用sixbox生成参数模板文件(YAML) , 并配置yaml文件

sixbox run --make-template 6oclock/VarScan-Somatic:v2.3.9 > varscan.job.yaml

vim varscan.job.yaml # 编辑参数配置文件，替换或设置参数以实现个性化分析

可以直接粘贴下方示例内容到varscan.job.yaml

out_file_name: NA12878_addsnv
tumor_pileup:  # type "File"
    class: File
    path: http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS/NA12878_addsnv.tumor.pileup
normal_pileup:  # type "File"
    class: File
    path: http://www.sixoclock.net/resources/data/NGS/Homo_sapiens/WGS/NA12878_addsnv.normal.pileup
​

使用sixbox运行 运行命令，

sixbox run  6oclock/VarScan-Somatic:v2.3.9  varscan.job.yaml

即可看到当前目录或者指定的输出目录输出对应的结果文件。运行日志如下：

{
    "snp_file": {
        "location": "file:///home/6oclock/project/cwlTests/vanscan_somatic_out.snp",
        "basename": "vanscan_somatic_out.snp",
        "class": "File",
        "checksum": "sha1$d4866a3b95da941fcd10f3543075996c75b00a6b",
        "size": 5620,
        "path": "/home/6oclock/project/cwlTests/vanscan_somatic_out.snp"
    },
    "indel_file": {
        "location": "file:///home/6oclock/project/cwlTests/vanscan_somatic_out.indel",
        "basename": "vanscan_somatic_out.indel",
        "class": "File",
        "checksum": "sha1$15e45c3b0a3287b82ad7278e09a2f573c85784e3",
        "size": 326,
        "path": "/home/6oclock/project/cwlTests/vanscan_somatic_out.indel"
    }
}
INFO Final process status is success

以上为我们给大家带来的肿瘤基因组体细胞的基本原理知识，以及在六点了平台上运行经典的VanScan的详细操作过程。如果对生物医疗健康大数据相关内容感兴趣也可以持续关注我们。

参考资料

• https://zhuanlan.zhihu.com/p/473757553
• sourceforge网站: http://varscan.sourceforge.net/
• sixoclock官网: http://www.sixoclock.net
• 六点了官网: http://www.sixoclock.net
• Koboldt, D., Zhang, Q., Larson, D., Shen, D., McLellan, M., Lin, L., Miller, C., Mardis, E., Ding, L., & Wilson, R. (2012). VarScan 2: Somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing Genome Research DOI: 10.1101/gr.129684.111