【1.1】Nanopore

ngs_topic 阅读量：次

纳米孔是唯一可以直接对RNA链进行测序的技术，可选择不经过逆转录或PCR反应。Nanopore直接RNA测序技术是对天然RNA进行测序，能够保留并检测RNA碱基修饰信息，对poly(A)尾长进行相对准确的估算，同时进行全长异构体分析，还原真实RNA特征。

Oxford Nanopore推出的纳米孔测序装置

一、基本介绍

1.1 工作原理

新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）；采用电泳技术。

Nanopore测序当中的核心部件是这个由蛋白质构成的纳米级的小孔，我们称之为“Pore”。

      这个蛋白质插在一层电阻率很高的薄膜当中。薄膜的两侧都浸没在含有离子的buffer当中。在薄膜的两侧加上不同的电位,离子就会通过蛋白质小孔，从膜的一侧移动到膜的另一侧，小孔当中就会有电流通过。当DNA的单链通过这个小孔的时候，就会对离子的流动造成阻碍。不同的碱基造成的阻碍大小是不一样的。这样，不同的碱基所造成电流大小的波动，就被记录下来。

  1. motor蛋白牵引DNA至nanopore并解链
  2. DNA的单链通过小孔的时候，会对离子的流动造成阻碍。 
  3. 不同的碱基所造成电流大小的波动，就被记录下来。

这些被记录下来的电流波动信号。经过分析，反推出原来经过小孔的是什么碱基。这就是Nanopore测序的基本原理。

  • Reader——跨膜蛋白，可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后，得到Nanopore测序所需的Reader蛋白。

  • Membrane——多聚物薄膜，Reader蛋白会被嵌入到高电阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，形成电流。

  • Motor——马达蛋白，在Nanopore文库构建时，需要在接头上连接一种马达蛋白，用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。

  • Tether——用于锚定DNA或RNA链，防止其在溶液中飘动，并使其进入纳米孔中。

1.2 实验设计

      Nanopore的这层膜，现在是用的人工合成的一种多聚物的膜。膜上嵌入的这个蛋白，是整个测序芯片的核心。Nanopore公司给它起了名字叫“Reader”。用作Reader的蛋白，一般是天然能形成穿膜孔的跨膜蛋白，再经过基因工程进行改造，这样得来的。

Nanopore公司已经试过了很多种跨膜蛋白来做这个Reader。目前R9版的芯片用的是一个来自于大肠杆菌的叫CsgG的蛋白质。在把这个蛋白做了几百处基因工程改造之后，用作Reader蛋白。之前Nanopore公司还用过Hemolysin蛋白和MspA蛋白（来做Reader蛋白）。Nanopore公司每换用一种新的Reader蛋白，就给新的芯片起一个新的版本号。例如：R7、R8等。现在用的芯片版本号是“R10”。

R7.3，3KHz，6mers/event；

R9，4KHz，5mers/event；

 在测双链DNA文库的时候，会用一个DNA解螺旋酶，来帮助解开DNA双螺旋，变成两条单链。以便其中一条单链能够穿过蛋白质小孔。这个DNA解螺旋酶，在这里也被称为“Motor”，就是动力（蛋白）的意思。

1.3 建库方法

1D文库测序，第1条DNA链测完以后，第2条链会脱离，后面也会测到，但是不会和第1条链对应上。

1D²文库，第1条DNA链测完以后，纳米孔会捕获互补链的马达蛋白进行互补链测序，但是互补链只是有一定概率能够紧接着被测序，两条链的数据相互校准，能够提高测序准确率（然并卵）。

此外， 2D的U型接头因侵权Pacbio，后弃用。

1.4 测序过程

      Nanopore公司目前开发了几种测序仪：最大的是PromethION，一次可以承载48张芯片（GridIONx5，可以一次承载5张芯片；MinION，可以承载1张芯片；）

一张芯片上有2048个Mux（Mux是Multiplexer的简称）。Mux（Multiplexer）是“多路复用器”的意思。在Nanopore的芯片上，它也体现为一个物理的小孔。相邻的每 4个Mux形成一个小组。这一个小组的4个Mux共享一个信号放大器（Amplifier）。

       一张芯片上有512个信号放大器，对应于512组Mux。在测序之前，机器会先把所有的Mux都通一下电，预测试一下。预测试完毕之后，机器就会知道每个小组当中，哪个Mux是最好的；哪个Mux是第二好的，再哪个是第三好的，哪个是排第四的。

      在测序的时候，机器会先用每组当中最好的那个Mux进行测序；运行8小时之后，换第二好的那个Mux，再测序8小时，然后再换；依此类推，直到4批Mux都用完。（在测序的过程当中，目前一开始是先用180毫伏的电压。然后每10分钟，要短时间地颠倒一下电压的方向，让电流短时间地反向走一下。这样做，是为了激活一些被堵住的、或者被卡住的Pore（蛋白质小孔），让这些Pore能够重新工作。这样颠倒电压，也可能会让部分已进入Pore、但还没有走完的DNA链被吐回去。）

       目前R9的芯片上，DNA链在Pore当中穿过的速度大约是每秒250个的碱基。所以10分钟能够测到全长为15万个碱基的一条单链（250 * 60 * 10 = 150,000）。

R9的芯片，开始测序的时候，是用180毫伏的电压。测序每进行2小时，要增加5毫伏的电压。这样做的原因是随着电极被用的时间越来越长，电极上的电压就会发生漂移。所以每2个小时，要增加5毫伏的电压来进行弥补。

      Nanopore建议严格控制测序芯片的温度保持在34℃。

       在实际的测序过程当中，并不是每个Mux都是有用的。据Nanopore公司公布的数据，2048个Mux当中，正常情况下会有1200个左右的Mux能够正常工作。

        您将看到通道在捕获一条链（变为亮绿色）时闪烁，并在下一条链之前短暂返回到空状态（深绿色）。 您可能还会注意到一些pore偶尔会变成Recoving（深蓝色）,这是正常行为，软件会在可能的情况下自动重新激活它们。

其概括为：

  1. Platform QC
  2. 散热片温度控温34℃ 
  3. 纳米孔使用情况
  4. 测序直方图
  5. Local basecalling

1.5 碱基判读

Nanopore的碱基判读是一个复杂的工作。

       因为目前蛋白Pore狭窄处的纵向长度，对应的是DNA单链上大约5个碱基的长度。所以在某一个时间点测到的电流信号，是这5个碱基共同作用的结果，而不是单个碱基的作用结果。这样就导致要从电流信号来判读碱基序列是一个复杂的过程。

      目前Nanopore做碱基判读的算法 ，是既观察电流的大小，又观察电流大小的变化。通过机器学习的得到的复杂算法对碱基进行判读。

      所谓的“机器学习”，大家听了也许会觉得特别深奥。我用通俗的话来说，就是“经验拟合”。

       DNA分子通过pore时的电流变化统计，五个碱基为一组信号，获取电流大小及电流变化的波形图，通过软件的参数修正，与数据库中已知序列的波形图进行比对，对碱基进行判读。

      把各种已知的碱基序列会给出的信号波形图，做成一个“图形库”。将新测到的未知序列的波型图，与现有的波形图库的去做比对，看哪个波型是比得上的。比对得上，那大体上就是那几个碱基。

      在比对的同时，再加上许多的修正参数，以提高比对的准确性。而这些修正参数，是拿大量的已知序列、和测到的波型图进行对照。经过反复试错、加上统计分析，得到的一系列优化值。用软件程序，通过试错、和统计，得到这些修正参数值的过程，就是“机器学习”。

       目前ONT的碱基判读，可以达到约85%~90%及以上。

1.6 数据处理

    ONT的下机数据格式为fast5，需要通过basecalling相关软件，转化为fastq。basecalling软件ONT服务器自带，同时在不断更新中，有albacore、guppy、flip-flop等。

    bascalling完的fastq数据，可进一步通过测序质量值过滤（官方推荐qual >7 or 11）.

    质控后的数据可经过minimap2、ngmlr等长序列比对软件和基因组进行比对。

数据通量：保守来说，R9芯片的通量在40~70G左右；reads num在4M~7M不等，经过qual过滤在2~5M 条。

1.7 主要优势

  • 长读长：Reads可达Mb；MinION用户迄今为止报告的最长读取长度为>4 Mb。

  • 设备成本低：测序芯片可清洗再生，重复利用；

  • 实时获得序列信息：最快可在1小时内完成测序流程及数据分析，满足动态检测宏基因组需求；

  • 便携式测序装置：重量轻且占用空间小，可以随身携带随时测序；

  • 直接测序：直接测序原始DNA和RNA，不需要进行PCR扩增，避免了扩增偏好性；保留了原始碱基修饰信息，能够直接读出甲基化的胞嘧啶。

三、应用

短读长、长读长与ONT直接RNA测序分析的比较

3.1 直接RNA测序无需PCR，没有测序GC偏好性

由于PCR 过程具有GC偏好性，对GC含量过高或过低的序列不容易扩增，所以短读长测序在建库和测序过程中都会引入GC偏好，降低了定量分析的准确性。使用ONT测序技术（直接 cDNA & 直接 RNA），无需PCR扩增，提供无偏倚、全长、链特异性的RNA序列。

纳米孔数据集里的GC偏倚低于短读长数据集

3.2 准确检测转录本 poly（A）尾长度

转录本 poly(A) 尾被认为在转录后调控中起到重要作用，包括mRNA的稳定性和翻译效率。poly(A)尾长度可达数百个核苷酸，使用短读长测序的数据很难进行测量。ONT直接RNA测序获得的全长转录本包含poly(A)尾信息，利用算法工具计算出poly(A)尾的长度，估算每个读长序列的poly(A)尾长，甚至能够发现异构体间poly(A)尾的区别。

Nanopore 直接 RNA 测序鉴定转录本 poly（A）尾长

3.3 直接 RNA 测序鉴定 RNA 碱基修饰信息

短读长测序由于在建库过程需要 PCR，从而丢失了 RNA 分子中的碱基修饰信息。直接 RNA 测序不需要扩增或链合成，这意味着在测序过程中，修饰碱基直接穿过纳米孔，在原始信号中产生与未发生修饰的碱基不同的电流特征。通过特定的软件算法对电流特征进行识别，即可鉴定碱基修饰信息。

Nanoproe 直接 RNA 测序检测天然 RNA 修饰

参考资料

药企，独角兽，苏州。团队长期招人，感兴趣的都可以发邮件聊聊：tiehan@sina.cn
个人公众号，比较懒，很少更新，可以在上面提问题，如果回复不及时，可发邮件给我： tiehan@sina.cn