【3.2.2】通过蔗糖梯度分级（Sucrose Gradient Fractionation）对 mRNA 翻译进行分析
从 mRNA 分子产生蛋白质的效率可能因转录本、细胞类型和细胞状态而异。准确测定 mRNA 翻译效率的方法对于获得对转录后基因调控的机制理解至关重要。测量翻译效率的一种方法是确定与 mRNA 分子相关的核糖体的数量，归一化为编码序列的长度。这种分析单个 mRNA 的主要方法是蔗糖梯度分级，它根据结合核糖体的数量物理分离 mRNA。在这里，我们描述了一个简化的协议，用于准确分析 mRNA 与核糖体的关联。与之前的协议相比，我们的方法结合了内部控制和改进的缓冲条件，共同减少了由非特异性 mRNA-核糖体相互作用引起的伪影。此外，我们的直接从馏分 qRT-PCR 协议消除了从梯度馏分中纯化 RNA 的需要，这大大减少了所需的动手时间，并促进了多个条件或基因目标的并行分析。此外，在此过程中不会产生苯酚废物。我们最初开发了协议来研究酿酒酵母中的HAC1 mRNA ，但我们还详细介绍了哺乳动物细胞系和组织的改编程序
一、背景
mRNA 向蛋白质的翻译是一个高度受管制的过程，根据基因、细胞环境或环境的不同，可以以不同的速度发生。翻译的每一步——起始、延伸和终止——都可以成为最终影响与 mRNA 相关的核糖体数量的调节点（Dever 和 Green，2012；Hinnebusch 和 Lorsch，2012）。由于连续起始事件之间的时间通常比延伸所需的时间短，因此大多数 mRNA 一次与多个核糖体相关联以形成“多核糖体”（polysome）结构（Warner等., 1963)。因此，计算每个 mRNA 分子核糖体数量的能力提供了对 mRNA 整体翻译状态的分析。
- 传统上，这种计数是通过蔗糖梯度分级（有时也称为多核糖体分析）实现的，其中 mRNA 根据其大小/形状通过超速离心分离，然后进行量化（Mašek等，2011）。可以通过 RNA 印迹或 qRT-PCR 对单个 mRNA 或通过微阵列或高通量 RNA 测序对整个转录组进行梯度级分中 mRNA 的检测（Arava等人., 2003; Floor 和 Doudna，2016 年）。通过这种方式，可以确定与单个 mRNA 分子相关的核糖体的绝对数量。
- 另一种检测翻译的方法是核糖体足迹分析，其中捕获受核糖体核糖体酶消化保护的 mRNA 短片段并进行高通量测序（Ingolia等，2009）。当结合总 RNA 测序来确定 mRNA 丰度时，核糖体分析数据可以以全基因组的方式测量 mRNA 的翻译效率。然而，核糖体分析仅提供翻译效率的相对测量，可能会受到 RNA 丰度测量的影响（Weinberg等人., 2016)。此外，核糖体分析不太适合低丰度 mRNA 的研究，或者当只有少数 mRNA 感兴趣时。
由于这些原因，蔗糖梯度分级仍然是分析翻译效率的重要工具。
我们介绍了这种广泛使用的技术的改编版，其中包含了提高准确性和减少动手时间的关键功能。通过蔗糖梯度分级分离的 mRNA 多核糖体分析分三个步骤完成：
- 裂解物制备、
- 蔗糖梯度分级分离
- RNA 丰度分析。
我们的协议最初是为了简化对多个 RNA 的并行分析而开发的，但在协议开发过程中，我们还仔细优化了每个步骤，以确保该测定提供了准确且可重复的核糖体关联测量。我们为芽殖酵母S. cerevisiae开发了方案（Di Santo等人，2016 年），但此后也将其应用于各种人类和小鼠细胞系，甚至整个小鼠组织（Odegaard等., 2016)。我们协议的一个关键特征是在裂解缓冲液中加入肝素，这减少了 mRNA 和核糖体之间的非特异性相互作用，否则可能导致未翻译 mRNA 与多核糖体的人工共沉淀。我们还对未翻译的 RNA 进行了可靠的控制：一种未加帽的外源 RNA，在超速离心前加入裂解液中。对于 RNA 分析步骤，我们采用了以前用于细胞裂解物的 qRT-PCR 试剂盒，直接使用梯度级分，从而消除了之前所有多核糖体分析协议中使用的耗时的 RNA 纯化步骤。直接从粗梯度馏分中测量RNA 丰度不仅减少了时间要求和手动操作，而且消除了苯酚废物的产生。最后，为了控制级分（蔗糖浓度和大分子组成不同）之间 RT-PCR 效率的变化，我们在收集后立即向每个级分中加入等量的人工 RNA，作为标准化参考。总之，我们的协议（在下面详细介绍）包含一系列改进和内部控制，它们共同为多核糖体分析提供了准确、简化的分析。
二、分析流程
Figure 1. Workflow schematic of the sucrose polysome gradient protocol from multiple cell types
图 2. 从该 polysome 梯度分析协议生成的代表性数据。顶部面板显示 A 260分馏酵母裂解物的吸光度曲线，并标注了与每个峰相关的核糖体种类。下图显示了与通过 qRT-PCR 分析的梯度的每个部分相关的 RNA 相对分布的代表性图。代表的是翻译抑制的 mRNA（橙色）、翻译良好的 mRNA（蓝色）和未加帽的荧光素酶 RNA（绿色），用作非特异性相互作用的对照。翻译良好的 mRNA 主要是多聚体和沉淀物，位于管底部的梯度深处。翻译抑制的 mRNA 和外源对照 RNA 都与核糖体无关，并保留在顶部部分。
(sam点评：这个图的横坐标代表什么呢？？？？)
参考资料
