【5.2.3】密码子优化的干扰素γ在CHO细胞中的增强表达

由于其免疫调节特性,人干扰素-γ(IFN-γ)是治疗各种疾病的潜在候选药物。可以通过流行的工业宿主中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来有效生产这种蛋白质。然而,外源蛋白的重组表达通常不是最佳的,这可能是由于在编码序列中使用了非天然密码子模式。因此,我们证明了最近开发的密码子优化方法在设计合成IFN-γ编码序列以增强CHO细胞异源表达中的应用。对于密码子优化,较早的研究建议主要根据宿主的高表达基因,根据选定的设计参数(例如单个密码子使用(ICU)和密码子上下文(CC))建立目标使用情况分布模式。但是,我们基于RNA-Seq的转录组分析表明,与其他微生物表达宿主大肠杆菌和酿酒酵母不同,CHO细胞中不同基因表达类别的ICU和CC分布模式相对相似。各种ICU和CC优化的IFN-γ在CHO细胞中的体内表达进一步证实了这一发现。有趣的是,与野生型IFN-γ相比,CC优化的基因表现出至少13倍的表达水平提高,而ICU优化的基因则观察到最大10倍的增长。尽管基于单个密码子(例如ICU)的设计标准已广泛用于基因优化,但我们的实验结果表明,密码子背景是改善CHO细胞中重组IFN-γ表达的相对更有效的参数。

  • 与野生型相比,密码子优化被用来使CHO细胞中的IFN-γ表达提高14倍。
  • RNA-Seq转录组分析显示CHO细胞中高表达和低表达基因之间的密码子使用模式相似。
  • 与常用的单个密码子用法相比,密码子上下文是CHO细胞中密码子优化更相关的设计参数。

一、前言

干扰素-γ(IFN-γ)是一种细胞因子,在调节先天和适应性免疫中具有多种作用(Schroder等,2004)。由于其对免疫系统的多效作用,已被探索为一种临床应用的免疫调节药物(Miller等,2009)。另外,已经研究了IFN-γ作为治疗许多疾病的潜在药物候选物,例如癌症(Windbichler等,2000),肝炎(Muir等,2006)和肺结核(Suarez-Mendez等,2004)。 )。值得注意的是,IFN-γ的生物工程形式,即IFN-γ-1b或Actimmune,已获得Intermune的许可并获得FDA的批准,可用于治疗慢性肉芽肿性疾病和严重的恶性骨病(Vilcek and Feldmann,2004)。虽然Actimmune已使用大肠杆菌表达宿主以非糖基化形式商业化生产,但实验证明IFN-γ的糖基化表现出更高的蛋白酶抗性,从而使蛋白质在血流中保留的时间更长(Sareneva等人。 ,1993,Sareneva等,1995)。确实,使用哺乳动物表达宿主产生IFN-γ可以通过类人蛋白的糖基化来潜在地改善药物的治疗效果。因此,开发在哺乳动物细胞系中,特别是与工业相关的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高效重组生产糖蛋白的技术,是生物技术研究的重要领域(Chu和Robinson,2001)。

然而,在重组表达的异源基因设计中,蛋白质翻译的瓶颈已被认为是重要的问题。异源蛋白质翻译不佳可能是由于表达宿主和重组基因之间密码子使用偏倚的差异(Gustafsson等,2004)。由于随机突变和选择压力,不同的生物可能已经进化为利用频率不同的同义密码子(Hershberg和Petrov,2008)。因此,当我们尝试在特定宿主生物(例如CHO细胞)中表达外源基因(例如人IFN-γ)时,密码子偏倚的差异会阻碍蛋白质翻译过程,从而导致宿主无法有效翻译。重组基因中可能经常出现的稀有密码子。因此,通过密码子优化重新设计编码序列已被实际用于使外源基因适应有效的异源表达(Welch et al。,2009b)。先前的研究表明,表达水平和密码子使用方式之间的相关性暗示了实现高蛋白表达的最佳密码子偏好性的存在(Gustafsson等,2004)。据报道,与其他基因相比,高表达基因的编码序列表现出明显的密码子使用偏倚或分布模式,被选择性地用于计算这种“首选”密码子使用,作为微生物细胞中密码子优化的参考(Karlin等等人,1998)。在这方面,重要的是检查在CHO细胞的高表达,中表达和低表达基因中是否也观察到这种独特的密码子偏倚。为此,我们对CHO细胞的基于RNA-Seq的转录组数据进行了分析,以检查密码子分布模式与基因表达之间的关系。

参考资料

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