【1.2.1】使用模板转换寡核苷酸(TS oligos,TSOs)进行高效的 cDNA 文库构建

一、cDNA 5' 末端的代表性不足

新兴的高通量技术(如 RNA-seq)能够以最少的 RNA 输入量对复杂转录组进行功能解剖。单个转录本的准确定量或未知转录起始位点的鉴定需要一种有效的方法将 mRNA 分子转化为全长 cDNA。然而,传统的 cDNA 构建方法通常会导致 cDNA 5' 末端的代表性不足。

这一结果对对非模式生物中的转录组分析或基因发现感兴趣的研究人员构成了重大的技术障碍[1,2]。

二、SMART 技术和模板切换寡核苷酸安全 5' 末端序列 SMART technology and template switching oligo secure 5' end sequences

最初于 2001 年描述的一种策略通常被称为“SMART”(RNA 转录物 5' 端的转换机制,switching mechanism at the 5' end of the RNA transcript)技术(Takara Bio USA,Inc)已显示出在生成全长 cDNA 文库方面的前景,甚至从单细胞来源的 RNA 样本 [1,3]。该策略依赖于莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV) 逆转录酶的内在特性和使用独特的模板转换寡核苷酸 (TS oligo,或 TSO,template switching oligonucleotide)。

在第一链合成过程中,当到达 RNA 模板的 5' 末端时,MMLV 逆转录酶的末端转移酶活性会在新合成的 cDNA 链的 3' 末端添加一些额外的核苷酸(主要是脱氧胞苷)。

这些碱基充当模板转换 (TS) 寡核苷酸锚定位点( template switching (TS) oligo-anchoring site)。在 TS 寡核苷酸和附加的脱氧胞苷片段之间进行碱基配对后,逆转录酶“转换”模板链,从细胞 RNA 到 TS 寡核苷酸,并继续复制到 TS 寡核苷酸的 5' 端。通过这样做,得到的 cDNA 包含转录物的完整 5' 端,并且选择的通用序列被添加到逆转录产物中。除了用 oligo dT 引物标记 cDNA 3' 端外,这种方法还可以以完全独立于序列的方式有效扩增整个全长转录本库 [4]。有关此方法的示意图,请参见图 1。

三、模板转换寡核苷酸 (TS) 结构

模板转换 (TS) 寡核苷酸的简单版本是一种 DNA 寡核苷酸序列,其 3' 末端带有 3 个核糖鸟苷 (rGrGrG) [1]。这些连续的 rG 碱基和 cDNA 分子的 3' dC 延伸之间的互补性赋予了随后的模板转换能力 [5]。最近的一项研究建议用锁定的核酸碱基替换 3' 最 rG,这可能是由于锁定的核酸单体的热稳定性增强,这将有利于碱基配对 [6]。

有趣的是,2013 年进行了一项系统研究,将多个修饰模板转换 (TS) 寡核苷酸版本并排比较,数据表明 RNA/DNA 杂合体提供了更高水平的 5' 帽特异性富集,即使预计 DNA/锁定核酸双链体在热力学上更受青睐[7]。

在对单细胞转录组学日益增长的兴趣的推动下,已经探索了替代修饰模式以进一步提高模板转换 (TS) 寡核苷酸的性能。例如,在 2010 年,研究人员报告了一种通过将异构核苷酸整合到 TS 寡核苷酸中来降低文库背景从而提高 cDNA 产量的方法 [8]。在这项研究中,将 2 个修饰碱基 iso-dC 和 iso-dG 附加到 TS 寡核苷酸的 5' 端。这两种修饰分别是胞嘧啶和鸟嘌呤的化学变体,它们彼此形成氢键,但不与天然存在的 C 和 G 核苷酸形成氢键。正如预期的那样,这个修改后的版本证明了在最大限度地减少 TS 寡核苷酸连接方面的功效,这通常是由逆转录酶活性循环引起的 [8,9]。

参考资料

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