【9.2】质粒的提取原理

质粒提取是指去除 RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。

目录

  • 一、质粒提取原理
  • 二、质粒提取方法
  • 三、质粒提取常见问题
  • 四、技术文档
  • 五、技术视频

一、质粒提取原理

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外,质粒DNA上携带了部分的基因信息,经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中,质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主细胞中提取质粒DNA,是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤:

  • 培养细菌使质粒扩增
  • 收集和裂解细菌
  • 分离和纯化质粒DNA。

在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒DNA链发生断裂。所以,多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒:

  • 共价闭合环状DNA(cccDNA): 质粒的两条链没有断裂;
  • 超螺旋开环DNA(ocDNA): 质粒的一条链断裂;
  • 松弛的环状分子线形DNA(lDNA): 质粒的两条链均断裂;
  • 线性分子质粒DNA的分子构型 。

质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为:松弛线性的DNA; 松弛开环的OC构型; 超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭,因此,在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿,OC DNA则位于凝胶的最后边;道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的,它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。

二、质粒提取方法

质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。

2.1 碱裂解法:

此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:

1.接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2.37℃振荡培养过夜。

3.取1.5ml菌体于Ep管,以4000rpm离心3min,弃上清液。

4.加0.lml溶液I(1%葡萄糖,50mM/L EDTA pH8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5.加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1% SDS),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。

6.加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),轻轻翻转混匀,置于冰浴5 min 。

7.以10,000rpm离心20min,取上清液于另一新Ep管

8.加入等体积的异戊醇,混匀后于0℃静置10min。

9.再以10,000rpm离心20min,弃上清。

10.用70%乙醇0.5ml洗涤一次,抽干所有液体。

11.待沉淀干燥后,溶于0.05mlTE缓冲液中

2.2 煮沸法:

1.将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。

2.弃上清,将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。

3.将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中,涡旋混匀。

4.加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5.将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6.用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7.用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8.取20ml进行电泳检查。

2.3 酚氯仿裂解法:

1.从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆,接种到标准LB培养液中(含有卡那霉素30 μg/mL)摇菌12 h;收集1.5 mL菌液,8000 g/min离心3 min,弃上清,沉淀加入200 μL TE,充分混匀;加入400 μL酚氯仿(1∶1体积)混合液,剧烈振动10 s,混匀;12 000 g/min离心5 min,1 mL胰岛素注射针收集上清,尽量避免吸入蛋白沉淀层;上清经国产0。22 μm针式滤器过滤1次;向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇,振荡10 s,12 000 g/min离心5 min;沉淀溶于20 μL的RTE溶液中,37℃水浴。

2.按PstI内切酶说明书进行酶切反应(37℃,1 h)。 酶切产物10 μL,10 g/L琼脂糖凝胶电泳。

3.PCR引物根据参考文献〔1〕设计,预计扩增产物片断大小为714 bp。

4.常规制备感受态菌E。coli DH5a,提取质粒DNA常规转化感受态,涂于含有卡那霉素(30 μ/mL)LB培养平板中,37℃培养,15 h后观察筛选克隆情况。

三、质粒提取常见问题

3.1 溶液I—溶菌液:

溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键,因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时,溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖:增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA:1. 螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基);2. EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

3.2 溶液II-NaOH-SDS液:

NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是稳定的。但当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L,加抽提液时,该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:1. 溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。2. 解聚细胞中的核蛋白。3. SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。

3.3 溶液III–3mol/L NaAc(pH4.8)溶液:

NaAc的水溶液呈碱性,为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液,调回pH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。

3.4 为什么用无水乙醇沉淀DNA?

用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。

3.5 在用乙醇沉淀DNA时,为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1~0.25mol/L?

在pH为8左右的溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。

3.6 加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?

加进去的RNase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。

3.7 为什么在保存或抽提DNA过程中,一般采用TE缓冲液?

在基因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH),可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCl系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

3.8 如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?

采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20%。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30% PEG,其最终PEG浓度为12%。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。

3.9 抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?

酞与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用。

3.10 为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戊酵?

在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24:1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加一份24:1的氯仿与异戊醇即成),同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

3.11 为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?

因为酚与水有一定的互溶,苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中,不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下(pH5~7),RNA比DNA更容易游离到水相,所以可获得RNA含量较少的DNA样品。

保存在冰箱中的酚,容易被空气氧化而变成粉红色的,这样的酚容易降解DNA,一般不可以便用。为了防止酚的氧化,可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1%。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末,不仅能抗氧化,并在一定程度上能抑制DNase的活性,它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚,最好分装在棕色小试剂瓶里,上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液,隔绝空气,以装满盖紧盖子为宜,如有可能,可充氮气,防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或-20℃冰箱中,使用时,打开盖子吸取后迅速加盖,这样可使酚不变质,可用数月。

3.12 未提出质粒或质粒得率较低?

1. 大肠杆菌老化

请涂布平板培养后,重新挑选新菌落进行液体培养。

2. 质粒拷贝数低

由于低使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低,可更换具有相同功能的高拷

贝数载体。

3. 菌体中无质粒

有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在,经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如,柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定,因此不要频繁转接,每次接种时

应接种单菌落。另外,检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

4. 碱裂解不充分

使用过多菌体培养液,会导致菌体裂解不充分,可减少菌体用量或增加溶液P1、

P2和P3的用量。对低拷贝数质粒,提取时,可加倍使用溶液P1、P2和P3,可能

有助于增加质粒提取量和质粒质量。

5. 溶液使用不当

溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊,应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的

溶液,才能使用。

6. 吸附柱过载

不同产品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的质粒量很大,请分多次提取。若

用富集培养基,例如TB 或2×YT,菌液体积必须减少;若质粒或宿主菌是非常高

的拷贝数或生长率,则需调整LB培养液体积。

7. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)

洗脱溶解质粒时,可适当加温或延长溶解时间。

8. 乙醇残留

漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体,树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂,再加入洗脱缓冲液。

9. 洗脱液加入位置不正确

洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

10. 洗脱液不合适

DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris?Cl, pH 8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内,如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

11. 洗脱体积太小

洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高,但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

12. 洗脱时间过短

洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。

3.13 质粒纯度不高?

1.混有蛋白

不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后溶液应为澄清的,如果还混有

微小蛋白悬浮物,可再次离心去除后再进行下一步骤。

2.混有RNA

RNase A处理不彻底,请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如

果溶液P1已保存6个月以上,请在溶液P1中添加RNase A。

3.混有基因组DNA

加入溶液P2和P3后应温和混匀,如果剧烈振荡,可能把基因组DNA剪切成碎片从

而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠,无法温和混匀,请减少菌体用

量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,不要超过16 小时。

4. P3溶液加入时间过长

P3溶液加入后,放置时间不要太长,否则有可能会产生小片段DNA污染。

5. 含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶,在质粒提取过程中降解质粒DNA,影响提取质粒DNA的完

整性,最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌,如DH5α和Top10。

6. 裂解时间过长

加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。

7. 质粒的二聚体和多聚体形式

质粒复制过程中形成的,与宿主菌相关,电泳可检测出。

参考资料

个人公众号,比较懒,很少更新,可以在上面提问题,如果回复不及时,可发邮件给我: tiehan@sina.cn

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