【9.1】质粒基本概念

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体。在分子生物学实验中,通常将目的基因插入到质粒的多克隆位点上,构建新的重组质粒,目的基因可以随质粒载体进入到受体细胞中。获得高品质的质粒对下游实验起到非常重要的作用。

质粒提取主要包括三个步骤:菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA,和质粒DNA的分离与纯化。质粒提取办法中,最常用的是碱裂解法,它具有得率高,适用面广,快速,纯度高等特色。

其原理是:强碱(pH12.0-12.6)环境下,SDS损坏细胞壁并裂解细胞,一同使宿主细胞的蛋白质、染色体及DNA发生变性,而质粒DNA因为其分子量小而缠结严密不易变性。pH调至中性时可恢复天然构象,在高盐条件下,细胞碎片、变性的蛋白质和染色体DNA发生沉积,离心后可去除。上清中的质粒DNA可经过乙醇沉积或许硅胶膜特异性吸附等方法,将质粒DNA从上清中回收。

一、质粒提取

1.1 质粒提取的办法有哪些?

能够用于质粒DNA分离纯化的办法有:碱裂解法、煮沸法、SDS裂解法和有机溶剂法等,大多数的质粒抽提试剂盒选用的办法是碱裂解法。针对于一些分子量大、仿制数低的质粒DNA,仅用试剂盒提取还很难取得高纯度、高浓度的质粒,需求试验者在理解质粒提取原理的基础上,针对不同的菌种、不同的质粒,有用操控提取过程中的各种要素,才能取得理想的成果。

1.2 影响质粒提取的要素有哪些?

质粒提取的纯度和得率与许多要素相关,比如:质粒本身的仿制才能、安稳性、宿主菌株的品种和培育条件、菌体裂解是否充分、抗生素、硅胶膜的吸附才能、试验者操作的熟练度等等,都会影响到质粒的提取作用。

1.3 提不出质粒或质粒提取量很少

  • 菌体中无质粒:有些质粒本身不能在某些菌种中安稳存在,经屡次摇菌后可能导致质粒丢失。

  • 菌种老化:假如是甘油菌,主张涂布平板培育后,重新挑选菌落后再进行液体培育。

  • 质粒拷贝数低:某些质粒归于低仿制类型,也会引起质粒提取量低,尽量换用相同功用的高仿制质粒,或许一同添加菌体和试剂的运用量

  • 碱裂解不充分:质粒提取过程中,并非菌体量越高提取量越高,运用过多的菌液,会导致菌体裂解不充分,可适当添加下流提取试剂的运用量或许减少菌液用量。

二、质粒的存储与纯化

2.1 质粒中基因组污染是怎样发生的?

基因组污染一般是因为操作过于剧烈发生的,假如为了进步混合作用,选用涡旋振荡的方法来进行混匀,基因组DNA会被剪成小片段,在中和过程中被复性,保留在上清中随质粒DNA一同被回收。所以在质粒提取过程中,动作要尽量温和。

2.2 为什么有些质粒,纯化后长时间放置会降解?

发生这种现象的主要原因是核酸酶污染,除了在制备时简单引进外源核酸酶之外,质粒宿主细胞也会影响抽提质量,JM系列细胞中含有丰富的核酸酶活性,假如制备的质粒需求长时间保存,主张替换宿主细胞,如DH5α、XL1-Blue,用于抽进步质量质粒。

2.3 之前测序没问题的菌液,37℃扩大培育后,质粒的巨细或序列出现异常?

这种情况一般出现在大质粒或较特别的序列中,可能是在大肠杆菌中仿制时发生了重组,能够替换重组酶缺失的菌株,比如JM109、sure菌株,使质粒仿制愈加安稳。

三、形态

3.1 电泳检测质粒DNA常见的几种形状

一般来说提取的质粒有三种形状,电泳图从上而下分别是开环DNA、线性DNA和超螺旋DNA。假如提取的质粒污染比较严重,在电泳图上乃至还会看到宿主细胞的基因组和RNA污染。双螺旋质粒的含量是判别质粒提取作用的重要指标,双螺旋质粒的转染功率最高。在实践操作过程中,有时我们只能看到两条条带,乃至是一条,能够经过单酶切线性化质粒和原始质粒一同进行电泳,线性化条带所处的方位指示的是质粒的实践巨细,而依据相对搬迁速度,来判别另一条条带是开环质粒还是超螺旋质粒。

3.2 质粒的拷贝数由什么决议的?

质粒依据仿制特性能够分为严紧型和松懈型,

  • 严紧型质粒在宿主细胞中仅含有1-2个,它的仿制与宿主细胞染色体受相同要素的操控,在必定的细胞周期内仿制。严紧型质粒分子量较大,比如F质粒和P1质粒。
  • 而松懈型质粒在宿主细胞中含有十几个,乃至是几十个,在整个细胞成长周期中能够随时仿制。松懈型质粒分子量较小,比如pBR322(15-20copies)、ColE1(20-30copies)、pUC(30-50copies)质粒。

一般情况下,质粒的仿制数是由其仿制子(ori的品种)决议的,有时也会遭到宿主细胞的品种、细胞的培育环境的影响。

3.3 常见的低仿制质粒是严紧型质粒吗?

商业化载体简直都归于松懈型质粒,但质粒的仿制数有所不同,比如植物表达载体pBI121,载体上含有从ColE1来历的ori仿制元件,虽然也是松懈型质粒,但相对于pUC质粒来说,仿制数较低,在质粒提取时,需求较大的菌体量,取得的质粒量才能到达试验需求。pBR322也是我们常见的一款低仿制质粒,包括一个仿制起点(ori)、一个Ampicilin抗性片段(AmpR)和一个tetracycline抗性片段(TetR),能够作为载体骨架,构建各类载体。pBR322的仿制子并不是一个能诱导超高仿制才能的起点,但也能够保证每个宿主细胞包括15-20个质粒。

针对于这类质粒,能够在得到部分成长的细菌培育物中参加氯霉素继续培育若干小时,氯霉素能够抑制宿主细胞中蛋白质的合成,阻挠细菌染色体的仿制,但是松懈型质粒仍可继续仿制,在参加氯霉素的若干小时内,仿制数继续递加。

3.4 应该选择什么等级的质粒?

不同等级的质粒适合于不同的下流试验,假如下流用于酶切、测序、亚克隆、转化和基因表达等常规分子生物学试验,手提和试剂盒提取制备的质粒均能到达需求。假如下流需求将质粒转染至细胞中或许显微注射到试验动物体内,则要求质粒的内毒素含量和超螺旋比例到达必定的标准。内毒素会影响质粒的转染功率和转染后细胞状况,质粒超螺旋比例越高,其转染功率及表达量也会越高。

参考资料

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