【2.15.2】冠状病毒病的治疗剂和疫苗的研究与开发

自从由SARS-CoV-2病毒引起的新型冠状病毒疾病COVID-19爆发以来,这种疾病已在全球迅速传播。考虑到大流行的潜在威胁, 科学家和医生一直在努力了解这种新病毒和这种疾病的病理生理,以发现可能的治疗方案并发现有效的治疗剂和疫苗。为了支持当前的研究和开发,CAS已编制了一份特别报告,以概述已发表的科学信息,并着重介绍CAS内容集中的专利。它着重介绍了涉及小分子和针对与冠状病毒感染和复制有关的复杂分子相互作用的生物制剂的抗病毒策略。本文记录的药物重用努力主要集中于已知对其他RNA病毒(包括SARS-CoV和MERS-CoV)有效的药物。冠状病毒相关生物制剂的专利分析包括针对病毒基因表达的治疗性抗体,细胞因子和基于核酸的疗法,以及各种类型的疫苗。超过500项专利公开了这四种生物制剂的方法学,它们具有治疗和预防冠状病毒感染的潜力,可能适用于COVID-19。本报告中包含的信息为治疗剂和疫苗的持续开发提供了坚实的知识基础。

一、前言

由新的冠状病毒2019-nCoV引起的新型冠状病毒疾病COVID-19的暴发,现已正式指定为与严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒SARS-CoV-2,对全球公共卫生构成大流行威胁。尽管2019年12月COVID-19暴发的震中位于中国武汉,但该病已蔓延到100多个国家(图1),全球确诊病例超过10万,确诊死亡3800例(图2)截至20203月9日,由于强制隔离隔离,数百万人的生活受到影响。如果不能有效控制病毒的传播,COVID-19爆发的连锁反应可能会给全球卫生系统带来重大挑战,并对全球经济产生深远影响。

冠状病毒(CoV)是相对较大的病毒,其中包含封装在膜包膜中的单链正义RNA基因组。病毒膜上散布着糖蛋白刺突,使冠状病毒具有冠状外观(图3)。尽管冠状病毒同时感染人类和动物,但某些种类的动物,例如蝙蝠等拥有最多类冠状病毒的动物似乎对冠状病毒引起的疾病具有免疫力。冠状病毒分为四类,分别为α,β,γ和δ。β型冠状病毒包括严重急性呼吸综合征(SARS)病毒(SARS-CoV),中东呼吸综合征(MERS)病毒(MERS-CoV)和COVID-19病原体SARS-CoV-2。与SARS-CoV和MERS-CoV类似,SARS-CoV-2攻击下呼吸道引起病毒性肺炎,但也可能影响胃肠系统,心脏,肾脏,肝脏和中枢神经系统,导致多器官功能衰竭。 当前信息表明,SARSCoV-2比SARS-CoV更具传播性/传染性。

β冠状病毒基因组编码几种结构蛋白,包括糖基化刺突(S)蛋白,该蛋白起宿主免疫反应的主要诱导作用。这种S蛋白通过与位于宿主细胞表面膜上的称为血管紧张素转化酶2(ACE2)的受体蛋白结合,介导SARS-CoV和SARS-CoV-2侵袭宿主细胞。最近的一项研究还显示认为这种入侵过程需要S蛋白引发(priming),宿主细胞产生的丝氨酸蛋白酶TMPRSS211促进了S蛋白的引发。此外,病毒基因组还编码了几种非结构蛋白,包括RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp),冠状病毒主蛋白酶(3CLpro)和木瓜蛋白酶(PLpro)。进入宿主细胞后,病毒基因组作为单链阳性RNA释放。随后,使用宿主细胞蛋白翻译机制将其翻译为病毒多蛋白,然后通过病毒蛋白酶3CLpro和PLpro将其切割成效应蛋白。PLpro也起去泛素化酶的作用,可能使某些宿主细胞蛋白(包括干扰素因子3)去泛素化。 RdRp合成了全长负链RNA模板,RdRp使用该模板制作更多的病毒基因组RNA。

病毒S蛋白与ACE2在宿主细胞表面上的相互作用非常重要,因为它可以启动感染过程。 Cryo-EM结构分析表明,SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2的结合亲和力比SARS-CoV S S蛋白高约10-20倍。据推测,这可能有助于报道 与SARS-CoV相比,SARS-CoV-2具有更高的传播性和传染性。

还存在发现靶向与SARS-CoV和SARS-CoV-2相关的高度保守的蛋白质的治疗剂的前景。尽管这两种病毒在基因组水平上仅表现出79%的序列相似性,但RdRp和3CLpro序列相似性超过95% ,根据序列比对和同源性建模,SARS-CoV和SARS-CoV-2共享一个高度保守的受体结合域(RBD) ),这是S蛋白的一个结构域,其S蛋白的序列相似性为76%。此外,尽管SARS-CoV-2和SARSCoV的PLpro序列只有83%相似,但它们共有相似的活性位点.

迄今为止,还没有SARS-CoV-2特异性抗病毒药。 研究人员一直在努力寻找可能的方法来挽救生命并生产疫苗以用于未来的预防。 为了支持研究发现COVID-19的有效治疗和预防剂的研发工作,美国化学学会专门研究科学信息解决方案的分会CAS一直分析与人类冠状病毒治疗剂和疫苗开发相关的科学数据。 2003年。本报告中的分析基于CAS内容收集,这是科学家策划的数据收集,涵盖了来自全球60多个专利机构的已发表的科学文献和专利。 对于部分分析,对CAS和MEDLINE数据进行了集体分析

二、有关COVID-19,SARS和MERS的科学文献和专利

2.1 与COVID-19相关的科学出版物的趋势

自COVID-19爆发以来,这种新疾病及其致病性病毒引起了全球的广泛关注。全球科学家和医师一直在开展一项重要活动,以了解这种新出现的疾病及其流行病学,以发现可能的治疗方案,发现有效的治疗剂并开发疫苗。图4显示了从2019年最后一周到2020年2月24日这一周每周发布的与COVID-19或SARS-CoV-2相关的期刊文章总数。在此期间,有500多种期刊文章以电子方式或印刷方式出版自2020年1月13日那一周以来,每周发表的文章数量都在增加。尽管这些文章中有很大一部分是关于临床表现和治疗选择的,但越来越多的研究集中在阐明病毒的结构,病毒传播机制/动力学,以及抗病毒药的鉴定和病毒检测的准确诊断。这些趋势反映了包括学术和工业组织以及临床医生在内的科学界的巨大兴趣和愿望,他们希望找到新的方法来制止这种流行病的发展并在将来防止感染和传播

2.2 与COVID-19和SARS-CoV-2相关的著名期刊文章。

表1列出了一些从2019年12月30日到2020年2月23日发布的期刊文章。这些文章是根据期刊影响因子,引文和研究类型等因素的共同使用而选择的。 例如,列出的有关SARS-CoV-2基因组特征的第8号文章极大地促进了全球开发预防COVID-19疫苗的努力。 该表中还显示了与潜在的抗病毒药物候选物有关的期刊文章,例如雷姆昔韦,巴利替尼和氯喹,用于治疗该疾病

2020年的前两个月发表了500余篇期刊文章,自2020年1月13日当周以来,每周发表的文章数量都在增加。

2.3 SARS和MERS相关的专利分布

如前所述,COVID-19由SARS-CoV-2引起,SARS-CoV-2是一种与SARS-CoV和MERS-CoV同属的新型冠状病毒。负责SARS-CoV-2进入宿主细胞并复制的病毒蛋白在结构上类似于与SARS-CoV相关的蛋白。因此,SARS和MERS的研究与开发可能会提供有益的见识,这将有助于COVID-19的治疗和预防剂的开发。该报告从与这两种冠状病毒有关的专利中确定了相关数据。图5显示了与SARS(A)和MERS(B)有关的CAS内容集中的专利分配。与SARS相关的专利数量几乎是与MERS相关的专利数量的12倍,这可能是因为SARS爆发发生在MERS爆发之前约10年。在SARS专利中,约有80%与疗法的发展,35%与疫苗有关,28%与诊断剂或方法有关。由于单个专利可能涵盖任何两个或更多区域,因此百分比值的总和大于100%。对于与MERS相关的专利,也发现了类似的分布方式。因此,对于两种疾病,与诊断方法和疫苗相反,更多的专利已投入治疗剂的开发。

三、用于COVID-19和相关冠状病毒疾病的小分子抗病毒药物的研究与开发

3.1 关键蛋白及其在病毒感染中的作用。

靶标的鉴定对于鉴定具有高靶标特异性的药物和/或发现可用于治疗SARS-CoV-2感染的现有药物非常重要。表2列出了潜在的靶标,它们在病毒感染中的作用,以及有代表性的现有药物或候选药物,据报道它们对相似病毒中的相应靶标起作用,因此需要评估其对SARS-CoV-2感染的影响。 3CLpro和PLpro是两种病毒蛋白酶,负责将病毒肽切割为功能单元,以便在宿主细胞内进行病毒复制和包装。因此,已经探索了针对其他病毒中这些蛋白酶的药物,例如HIV药物,洛匹那韦和利托那韦。RdRp是负责病毒RNA合成的RNA聚合酶,可能会被现有的抗病毒药物或候选药物(例如雷姆昔韦)阻断。可以想象,病毒S蛋白与其在宿主细胞上的受体ACE2的相互作用以及随后向细胞内的病毒内吞作用也可能是可行的药物靶标。例如,广谱抗病毒药物Arbidol作为病毒-宿主细胞融合抑制剂,可防止病毒进入针对流感病毒的宿主细胞,已进入治疗SARS-CoV-2的临床试验。蛋白酶TMPRSS2宿主细胞产生的蛋白在S蛋白引发的蛋白水解过程中起着重要作用,该蛋白向人体细胞中的受体ACE2结合。已证明,经过临床批准的TMPRSS2抑制剂camostat甲磺酸盐能够阻止SARS-CoV-2进入。对人细胞的杀伤力,表明其作为COVID-19药物的潜力

ACE2与冠状病毒感染的关系更加令人关注,因为ACE2是一种有效的负调节剂,可抑制肾素-血管紧张素系统(RAS)的过度活化,此外,它在调节血压方面也可能引起炎症性肺疾病。它催化血管紧张素II降解为血管紧张素(1-7)。血管紧张素II与血管紧张素(1-7)之间的平衡至关重要,因为血管紧张素II与血管紧张素AT1受体结合会引起血管收缩,而血管紧张素(1-7)引起AT2.25-27介导的血管舒张,尽管ACE2介导冠状病毒入侵由于研究数量有限,目前尚不清楚冠状病毒诱发的疾病中ACE2,AT1受体和AT2受体的水平或活性如何改变[23,24],因此尚待确定是否某些药物或靶向任何这些蛋白质的化合物(例如,L-163491作为AT1受体的部分拮抗剂和AT2受体的部分激动剂)可以减轻冠状病毒引起的肺损伤。

3.2 与关键蛋白质靶标相关的专利和潜在药物候选者。

CAS内容集包含与上述冠状病毒关键蛋白有关的专利。 表3列出了与每个蛋白质靶标和相关治疗化合物有关的专利数量,这些专利中报告了CAS登记号(CAS RN)。 CAS数据显示,目标3CLpro和RdRp比其他目标引起了更多关注,并且针对这些目标鉴定出了更多具有治疗潜力的化合物,这可能是由于SARS-CoV也包含3CLpro和RdRp的结果

3.3 具有COVID-19潜在治疗应用的现有药物。

由于SARS-CoV-2是新发现的病原体,因此尚未发现或目前尚无特定药物。一种经济有效的治疗策略是重新利用现有药物。基于基因组序列信息和蛋白质结构建模,科学界已经能够迅速提出建议的具有COVID-19治疗潜力的现有药物清单。表4总结了此类药物及其潜在的作用机理。提出Barcitinib的原因是其具有抗炎作用和可能减少病毒进入的能力。目前正在与Arbidol或利巴韦林(ribavirin)进行固定剂量的抗HIV组合洛匹那韦-利托那韦)(lopinavir−ritonavir)的临床试验。Remdesivir,由Gilead Sciences开发,之前曾在埃博拉病毒病患者中进行过测试,并已在MERS和SARS的动物模型中显示出希望。目前,该药物正在中国和美国进行III期临床试验。 Favipiravir是一种嘌呤核苷,可导致不正确的病毒RNA合成,最初是由日本Toyama Chemical开发的,最近被批准用于治疗COVID-19的药物,作为抗疟疾药物的临床试验已被证明可有效治疗中国的冠状病毒32。除上述提到的以外,还列出了许多其他抗病毒药物

3.4 与有希望的小分子药物候选者相关的精选专利。

表5列出了与上述潜在药物相关的选定专利,以及公开了用于治疗SARS或MERS的小分子专利。选择依据是CAS索引专利中重要术语的存在以及合成制剂的作用,由CAS科学家在文档编制索引期间进行。专利申请WO2009114512和WO2014028756公开了具有JAK抑制剂活性的化合物的制备,其中一种后来被称为baricitinib并且被开发用于减轻类风湿性关节炎中的炎症。专利申请JP5971830公开了多环吡啶酮化合物的制备及其作为核酸内切酶抑制剂的用途。专利申请US20160122374和US20170071964公开了核苷酸类似物雷姆昔韦(remdesivir)的制备,其后来被开发为埃博拉和马尔堡病毒感染的治疗剂(专利US20170071964)。由于其在至少两名COVID-19患者中的有希望的结果,瑞姆昔韦(remdesivir)现已进入III期临床试验

专利申请WO2013049382公开了来自各种结构类别(肽醛,肽基α-酮酰胺,肽基亚硫酸氢盐和肽基杂环)的化合物的结构和合成,以及某些制剂组合物,其被开发来抑制病毒3C蛋白酶或3C样蛋白酶。 (即3CLpro)

专利申请WO2018042343提供了能够抑制SARS病毒蛋白酶的化合物的制备方法和生物学测定结果。 这些化合物表现出良好的酶抑制活性(pIC50≈7或IC50≈0.1μM)和抗病毒活性,这是通过使用感染了特定病毒(例如MERS病毒)的人肺成纤维细胞MRC-5细胞通过宿主细胞生存力评估的表达病毒S蛋白。 该专利中还提到了药物给药途径

3.5 小分子化合物的研究与开发可能对人类冠状病毒引起的疾病的关键蛋白质靶标产生影响

除了各种商业化的抗病毒药物外,目前还在研究和开发中的小分子化合物对来自类似冠状病毒(如SARS-CoV和MERS-CoV)的许多关键蛋白表现出显着的抑制作用(表6)。这些候选药物主要抑制病毒酶,包括蛋白酶和RdRp的成分。由于3CLpro蛋白酶在SARS-CoV和SARS-CoV-2之间具有高水平的序列同源性,所以针对SARS-CoV的3CLpro的抑制剂也可适用于SARS-CoV-2。测试了可能抑制病毒NSP15活性,聚(U)特异性核糖核酸内切酶活性的化合物,包括苯并嘌呤B,C-467929,C-473872,NSC-306711和N-65828,以降低培养细胞中SARS-CoV的感染性IC50为0.2-40μM。化合物C-21和CGP-42112A是两种AT2激动剂,而L-163491具有AT2受体部分激动剂和AT1受体部分拮抗剂的双重功能。由于AT1和AT2在ACE2所属的RAS系统中是重要的作用因子,因此推测这些化合物可用于调节AT1和AT2之间的平衡,这可能受到冠状病毒感染的影响并减轻病毒性肺损伤在感染期间。

3.6 通过结构相似性,Lipinski的5法则以及CAS索引的药理活性和/或治疗用途确定的小分子。

除上述抗病毒药物外,可能还有其他具有抗病毒或药理作用的小分子化合物,例如SARS-CoV和MERS-CoV。使用CAS专有指纹在CAS REGISTRY中对表4和6中列出的化合物进行了Tanimoto相似度搜索。鉴定出结构相似度至少为60%且满足Lipinski规则5的那些物质。表7列出了还被鉴定为具有药理活性或治疗用途作用的所选化合物。每个化合物均提供了化合物名称和CAS RN。第二列列出了符合结构相似性和Lipinski规则标准的化合物数量。尽管在这方面还有更多工作要做,但此处提到的方法和结果指出了可以帮助简化COVID-19药物发现过程的策略。

四、冠状病毒相关疾病的生物制剂

4.1与SARS和MERS相关的生物制剂专利的分配。

与SARS和MERS病毒有关的新型冠状病毒SARS-CoV-2正在世界范围内引起严重且持续的流行病学问题。由于此时的临床和基础研究信息有限,因此COVID-19的治疗选择目前包括研究药物和症状管理。由于生物制剂有潜力拓宽冠状病毒诱发疾病的治疗选择范围,因此利用用于解决SARS和MERS暴发的现有知识和实践,可以为开发针对SARS-CoV-2的新型靶标特异性治疗剂提供实用的策略。为此,对CAS内容集中所含专利的生物制剂进行了分析。专利分析包括从2003年至今的专利中与治疗性抗体,细胞因子,干扰和其他治疗性RNA以及用于潜在治疗和/或预防SARS相关疾病的疫苗有关的信息。图6显示了500多项专利,这些专利公开了使用这四种生物制剂来治疗和预防SARS和MERS。在这些专利中,疫苗的开发是最大的类别(363),其次是治疗性抗体(99),干扰RNA(35)和细胞因子(22)。鉴于疫苗在病毒性疾病预防中不可或缺的作用,疫苗的详细分析将在下一部分中介绍。

4.2 抗体

确定了99项专利,其中包含有关对SARS和MERS具有治疗和/或诊断潜力的抗体的信息。 其中61项专利要求保护SARS特异性抗体(23),MERS特异性抗体(17)或具有诊断应用的抗体(21)。 与SARS-CoV相似,SARS-CoV-2的S蛋白中的受体结合结构域(RBD)与人ACE2受体结合,以便进入宿主细胞。在病毒感染中,S蛋白但不是 SARS-CoV中的其他结构蛋白M,E和N引发免疫反应。表8显示了与开发SARS治疗性抗体相关的专利的靶标分析。 这些抗体中超过90%针对包括RBD在内的S蛋白。 数据表明,S蛋白是SARS-CoV-2抗体开发的假定靶标。

另外38项专利包含有关可用于SARS和MERS治疗的其他类型抗病毒抗体的信息。这些包括中和抗体或设计用于靶向蛋白质的抗体,例如IL-6 / IL-6R,TLR3(Toll样受体3),CD16,ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序),DC-SIGN(树突状细胞特异性细胞间粘附分子) -捕获非整联蛋白),ICAM-3(细胞间粘附分子3)或IP-10 / CXCL10(干扰素γ诱导蛋白10)。据报道,细胞因子风暴与SARSCoV-2感染中的疾病严重程度相关。进入ICU的患者具有较高的促炎细胞因子和趋化因子浓度,尤其是G-CSF,IP-10 / CXCL10,MCP1(单核细胞趋化蛋白1)和TNFα,以及T辅助2细胞(例如IL-参见图4和IL-10.44,专利申请WO2005058815公开了人抗IP-10抗体,包括以高亲和力与IP-10结合的双特异性分子和免疫缀合物,用于治疗炎症,自身免疫性疾病,神经退行性疾病,细菌感染和病毒感染。专利申请WO2017095875公开了特异性靶向趋化因子IP-10的人抗体和免疫缀合物的制备,包括显示在食蟹猕猴以0.5mg / kg的约3天和以10mg / kg的约10天抑制游离血清IP-10的抗IP-10抗体。

此外,具有C型凝集素功能的II型跨膜粘附分子DC-SIGN / CD209主要在间质树突状细胞和肺泡巨噬细胞中表达.DC-SIGN作为将SARSCoV转移至易感细胞如。专利申请WO200505824要求保护人源化抗DC-SIGN抗体的产生,该抗体干扰DC-SIGN与其受体ICAM-3的相互作用。 该抗体可有效阻断病毒结合,感染以及包括SARS在内的病毒感染/疾病的传播

4.3 细胞因子 Cytokines

细胞因子是低分子量蛋白质,在对病原体入侵的免疫反应中充当化学信号。 响应入侵的病原体(例如病毒),各种细胞因子的产生有助于宿主生物消除病原体的能力。 在过去的40年中,已有文献报道了特定类型的细胞因子,包括趋化因子,干扰素(IFN),白介素和淋巴因子。 到2020年初,CAS词典包含700多个术语,用于与76724个文档相关的特定类型的细胞因子,包括11 837项专利。

在病毒感染期间,产生的最主要的细胞因子是干扰素,它们会干扰病毒的复制。 IFN分为I型(IFN-α,IFN-β,IFN-δ,IFN-ε,IFN-κ,IFN-ν,IFN-τ和IFN-ω),II型(IFN-γ)或 干扰素和干扰素融合蛋白因其干扰病毒复制的能力而被用作治疗III型病毒(IFN-λ)的基础,并且具有序列同源性。 过去20年 以下介绍了公开这些蛋白质及其在治疗SARS中的用途的一些专利

rSIFN-co。 专利申请WO2011072487和WO2016180335描述了重组干扰素(rSIFN-co,CAS RN 2043378-94-3)的克隆以及确定其有效治疗包括SARS在内的各种病毒感染/疾病的效力的方法。 本发明涉及rSIFN-co具有与Infergen(118390-30-0)相同的氨基酸序列,但是其具有改变的空间构象和不同的生物学效能。 rSIFN-co不仅具有比临床上可用的干扰素强20倍的抗病毒活性,而且还具有比其他重组人α-干扰素明显更强的抗乳腺癌和宫颈癌的抗肿瘤特性。 本发明进一步涉及rSIFN具有降低的毒性和副作用并且可以安全地以大剂量使用(每个剂量可以> 1000万IU),从而使得可以成功地治疗一些需要大剂量干扰素的病毒性疾病或肿瘤。

干扰素-ω。 专利申请WO2004096852公开了重组人干扰素ω(rhIFN-ω)(RN 791910-34-4)的氨基酸序列,该氨基酸序列显示具有与IFN-β相似的抗SARS病毒活性。 IFN-ω有效降低了猴子的疾病严重程度并抑制了冠状病毒BJ01株的增殖。

IL-28A(IFN-λ2),IL-28B(IFN-λ3)和IL-29(IFN-λ1)变体。 专利申请WO2005097165要求保护一种使用与聚合物(例如聚乙二醇)缀合的IL-28A,IL-28B和IL-29半胱氨酸变体治疗SARS病毒感染的方法,并公开了这些半胱氨酸变体的氨基酸和核酸序列。 在这些变体中,MetIL-29C172S-PEG(RN 867228-40-8)特别显示抑制病毒复制。

4.4 RNA疗法

RNA干扰(RNAi)是一个生物过程,其中小的互补RNA双链体靶向并中和了特定的mRNA分子,从而导致基因表达或基因翻译受到抑制。干扰RNA包括microRNA和小的干扰RNA(siRNA),通常长度约为21-25个核苷酸。短发夹RNA(shRNA)是人工合成的RNA分子,旨在折叠成紧密的发夹构象,使它们能够沉默其靶基因,并可以用作siRNA的前体。 shRNA在细胞中的表达通常是通过质粒,病毒或细菌载体的传递来完成的。尽管microRNA是非编码的,并且天然存在于植物,动物和某些病毒中,但合成形式目前正用于沉默多种基因。 化学合成微小RNA和siRNA的修饰类似物的能力,能够改变与疾病相关的基因表达或抑制病原体基因的表达,创造了许多新的治疗选择。

与microRNA和siRNA相比,反义RNA是天然存在或合成的单链RNA,通常长约19-23个核苷酸,其序列与编码mRNA的蛋白互补,从而可杂交并阻断蛋白翻译

自1990年代后期发现RNAi以来,它已成为沉默/抑制与毒力和致病性相关的靶基因的众所周知的方法。 CAS内容集中的35项专利公开了RNAi在治疗SARS中的用途,其中28项使用siRNA分子专利,三项使用反义寡核苷酸的专利,两项使用RNA适体的专利,一项使用核酶的专利以及一项使用microRNA抑制剂的专利。 。 支持信息表S1提供了这35项专利的高级视图,包括特定的RNAi靶标。 其中一些专利将在下面进一步讨论

靶向冠状病毒蛋白M,N或E的siRNA。专利申请CN101173275公开了两个双链RNA(dsRNA),这些双链RNA被设计为特异性靶向SARS蛋白M mRNA的两个单独区域。 靶向蛋白M mRNA 220-241区域的siRNA-M1序列对应于CAS RN 1023405-01-7和1023405-02-8,而靶向460-480区域的siRNA-M2序列对应于CAS RN 1023405-03- 9和1023405-04-0。 这两种siRNA对SARS M蛋白基因表达的干扰效率大于70%。

专利申请CN1648249公开了与专门设计用于靶向SARS的M,N和E基因的siRNA相关的序列。 已显示这些siRNA中的三个(第15、58和90号)分别抑制GFP-M,GFP-N和GFPE融合蛋白的表达。 制备另外三个siRNA(8 *,51 *和56 *号),其在有义链的3’末端(粗体字母)包含突变。 与原始siRNA相比,这些修饰的siRNA(如下所示)表现出对SARS病毒基因表达的抑制作用增强

靶向复制酶和RNA聚合酶区域的siRNA。 专利申请US20050004063公开了靶向SARS的复制酶1A区域的六个siRNA(SARSi-1至SARSi-6),其被显示抑制病毒感染和复制,其中SARSi-4是最有效的。 下表显示有义链序列和相应的CAS RN。 本发明还公开了靶向S,E,N和M基因的SARSi-7至SARSi-11。

作者证明了SARSi-2,SARSi-3,SARSi-4和SARSi-7-11抑制了FRhk-4细胞中的冠状病毒感染和复制。 SARSi-4最有效,几乎具有完全抑制作用,其次是SARSi-2和SARSi-3。

专利申请CN1569233公开了表11中所示的靶向编码SARS基因的siRNA,所述SARS基因编码RNA依赖性RNA聚合酶,解旋酶,核蛋白N和蛋白水解酶。 这些siRNA能够抑制或杀死SARS病毒BJ01株的50-90%,其中靶向蛋白水解酶的siRNA最为有效。

RNA适体。 两项韩国专利描述了使用RNA适体来抑制SARS病毒。 专利申请KR2009128837将RNA适体鉴定为能够结合并抑制SARS病毒解旋酶的双链DNA解旋的抗SARS剂。 相关专利申请KR 2012139512描述了对SARS-CoV的核衣壳具有独特亲和力的RNA适体,用于潜在的药物用途。

核酶。 专利申请JP2007043942描述了一种治疗性RNA / DNA嵌合核酶,其被设计用于识别和切割包括SARS在内的冠状病毒基因中的保守的共同区域和具有环结构的区域。 该核酶特异性识别具有环构象的病毒基因中的GUC

反义寡核苷酸。 还已经开发了反义寡核苷酸以降低SARS病毒感染的严重性并预防或治疗SARS病毒相关疾病,检测人样品中的病毒以及诊断SARS病毒相关疾病。 由Ionis Pharmaceuticals公开的专利申请WO2005023083描述了杂合的DNA / RNA反义寡核苷酸,其被设计用于破坏SARS冠状病毒RNA的移码位点中的假结。 除了直接靶向病毒外,反义寡核苷酸还可用于靶向与炎症过程有关的疾病相关蛋白。

五、疫苗

开发安全有效的疫苗以控制COVID-19大流行,消除其传播并最终防止其未来复发至关重要。 由于SARS-CoV-2病毒与另外两种致命的冠状病毒SARS和MERS具有显着的序列同源性,因此在这些与SARS和MERS病毒相关的专利中鉴定出的疫苗可能会促进抗SARS-CoV-2疫苗的设计。

5.1 疫苗类型中与SARS和MERS相关的专利分布。

抗病毒疫苗通常属于以下类型之一:无活性或减毒活病毒,病毒样颗粒(VLP),病毒载体,基于蛋白质的疫苗,基于DNA的疫苗和基于mRNA的疫苗。 CAS内容集中有363项与疫苗开发相关的专利,用于预防病毒性疾病/疾病,包括SARS和MERS。 其中,有175项专利公开了可能与SARS和MERS相关的非冠状病毒疫苗,而有188项专利与抗SARS和抗MERS疫苗直接相关,并具有明显的免疫反应。 支持信息表S2包含有关这些SARS / MERS疫苗相关专利的附加信息

图7显示了与SARS和MERS相关的这些疫苗类型之间的专利分配。 可以看出,有15项专利公开了有关灭活和减毒活病毒疫苗的信息,有28项专利公开了DNA疫苗,有21项专利公开了关于病毒载体疫苗的信息,有13项专利公开了关于VLP疫苗的信息,还有3项专利针对mRNA疫苗。

据报道,与减毒活的SARS-CoV,全长S蛋白和基于DNA的S蛋白疫苗相比,病毒S蛋白亚单位疫苗产生更高的中和抗体效价和更全面的保护。毫不奇怪,约有一半的专利集中在 包含S蛋白亚基疫苗的蛋白疫苗和特异性靶向病毒S蛋白S1亚基的受体结合域(RBD)的疫苗。 总的来说,S蛋白/基因是SARS / MERS疫苗开发中的首选目标位点,并且相同的策略可能在开发SARS-CoV-2疫苗中可能有用。 紧随其后的是几篇专利简明报告,这些专利描述了可产生抗SARS和MERS免疫力的疫苗

5.1 减毒病毒疫苗(Attenuated Virus Vaccines)

专利申请US20060039926公开了减毒的冠状病毒活病毒或弓形病毒活疫苗。 向Orf1a / b多蛋白(p59 / nsp14 / ExoN)中引入突变(Y6398H),可完全减弱小鼠冠状病毒(MHV-A59)的毒力。 减毒的MHV病毒在脑接种后第五天在小鼠中的复制减少

5.2 基于DNA的疫苗

专利申请WO2005081716公开了用于诱导/增强针对SARS冠状病毒的抗原的免疫应答,特别是抗原特异性CD8 + T细胞介导的应答的组合物和方法。 通过编码与至少一种来自SARS-CoV的抗原性多肽或肽连接的内质网伴侣蛋白多肽(例如钙网蛋白)的嵌合核酸在体内诱导涉及特别是细胞毒性T细胞免疫应答的免疫应答的增强。 使用基因枪传递覆有DNA的金颗粒,对小鼠进行的针对钙网蛋白-核衣壳融合蛋白的疫苗接种可产生有效的核衣壳特异性体液和T细胞介导的免疫反应。 接种疫苗的动物能够显着降低表达SARS病毒N蛋白的具有挑战性的牛痘载体的滴度

专利申请WO2015081155公开了免疫原,其包含衍生自MERSCoV刺突蛋白的共有蛋白,用于靶向MERS-CoV的基于DNA的疫苗。 共有刺突蛋白显着诱导体液和细胞免疫反应,包括增加的IgG滴度和中和抗体。 诱导的细胞免疫反应涉及增加的CD3 + CD4 +和CD3 + CD8 + T细胞反应,产生IFN-γ,TNF-α,IL-2或同时产生IFN-γ和TNF-α。 2020年3月3日,Inovio Pharmaceutical,Inc.宣布已设计出名为INO-4800的DNA疫苗,该疫苗计划于4月在美国进行人体试验。

5.3 基于蛋白质的疫苗

葛兰素史克公司(GSK)的专利申请WO2010063685公开了一种能够引起针对SARS的保护性免疫应答的疫苗。该疫苗包含S蛋白免疫原和水包油乳剂佐剂。工程化的胞外域免疫原(可溶性S蛋白)与乳剂佐剂GSK2结合,可在动物模型中诱导高水平的抗SARS-CoV IgG2a或IgG2b抗体应答并中和抗体应答。 2020年2月下旬,葛兰素史克(GSK)宣布与中国公司Clover Biopharmaceuticals合作评估一种冠状病毒(COVID-19)候选疫苗。该合作将涉及将Clover的基于蛋白质的冠状病毒候选疫苗(COVID-19 S-Trimer)与GSK的辅助系统。通过应用Trimer-Tag技术,Clover使用基于哺乳动物细胞培养的快速表达系统生产了S-Trimer亚基疫苗。 Trimer-Tag是一个先进的药物开发平台,可以生产新颖的,共价三聚化的融合蛋白,从而更好地靶向先前的非药物途径

专利申请US20070003577公开了与SARS冠状病毒的S蛋白相关的免疫原性组合物和疫苗。 从重组全长三聚体S蛋白制备了TriSpike SARS冠状病毒疫苗。 重组蛋白显示出(1)具有天然抗原性,如与恢复期SARS患者血清的反应性所表明; (2)表现出与可溶性ACE2受体的特异性结合; (3)促进原本难治的人Raji B细胞中抗体依赖性病毒的进入; (4)在动物模型中引起针对攻击性感染的保护。

专利申请US20060002947(Generex的子公司Antigen Express,Inc.)公开了由三种成分组成的杂合肽的制备,包括(a)用于抗原呈递增强活性的恒定链(Ii)关键肽,(b)化学结构 将Ii连接至抗原表位,以及(c)与II类MHC分子结合的抗原表位。 该方法用于创建Ii-Key / MHC II SARS杂种。 近日,Generex宣布与中国技术交流中心,北京中华投资基金管理公司,山东省科学院生物研究所以及SinotekAdvocates国际产业发展公司组成的中国财团签订合同,正在开发COVID-19疫苗。 该公司将利用其Ii-Key免疫系统激活技术生产用于人类临床试验的COVID-19病毒肽。

5.4 病毒样颗粒疫苗。

2015年,Novavax的专利申请WO2015042373公开了一种免疫原性组合物,该组合物由杆状病毒在Sf9细胞中过度表达产生,包含至少一个S蛋白三聚体的MERS-CoV纳米颗粒VLP。当与它们的专有佐剂基质M(RN 1235341-17-9)一起给药时,这种VLP制剂在小鼠和转基因牛中诱导了中和抗体应答。另外,在用MERS-CoV攻击之前,将来自接种牛的血清制剂(SAB-300或SAB-301)注射到Ad5-hDPP4转导的BALB / c小鼠中。 SAB-300和SAB-301都能够通过一次预防性注射保护这些小鼠免受MERS-CoV感染。 Novavax在2020年2月26日宣布,由于他们以前与其他冠状病毒(包括MERS和SARS)合作的经验,因此正在开始对潜在的COVID-19候选疫苗进行动物测试。使用重组纳米颗粒疫苗技术及其专有佐剂Matrix-M开发了针对SARS-CoV-2 S蛋白的COVID-19候选疫苗

5.5 基于mRNA的疫苗

预防性疫苗的mRNA方法的潜在优势包括模仿自然感染以刺激更有效的免疫反应的能力,以及将多种mRNA组合成单一疫苗的能力。 Moderna的专利申请WO2017070626公开了mRNA疫苗,该疫苗由配制于阳离子脂质纳米颗粒中的编码来自SARS-CoV和MERS-CoV病毒的抗原性病毒全长S,S1或S2蛋白的mRNA组成。他们显示,接种编码冠状病毒全长S蛋白的mRNA的小鼠产生了很多 与编码S蛋白S2亚基的mRNA相比,中和抗体的效价更高。用编码全长S蛋白的MERS-CoV mRNA疫苗免疫的新西兰白兔减少了90%以上的兔子肺部病毒载量,并诱导了大量针对MERS-CoV的中和抗体。 Moderna在202055年2月24日宣布,它已发布第一批针对SARS-CoV-2的mRNA-1273供人类使用,该方法是使用其先前专利中概述的方法和策略制备的。小瓶mRNA-1273已被运送到美国国立卫生研究院(NIH)的一个部门-美国过敏和传染病研究所(NIAID),用于 计划在美国进行1期研究。 Moderna报告说,mRNA-1273是针对与SARS-CoV-2相关的S蛋白预融合稳定形式的mRNA疫苗,由Moderna与NIAID疫苗研究中心的研究人员合作选择。该批次的生产由流行病防制创新联盟资助

专利申请WO2018115527描述了包含编码MERS冠状病毒的至少一种抗原的mRNA的疫苗,所述MERS冠状病毒优选为S蛋白或S蛋白片段(S1),包膜蛋白(E),膜蛋白(M)或核衣壳蛋白(N ),所有这些都可有效诱导抗原特异性免疫反应。 皮内注射编码MERS-CoV S蛋白的脂质纳米颗粒(LNP)封装的mRNA混合物对小鼠进行皮内给药可导致体内翻译并诱导体液免疫反应。

六、总结与观点

本报告基于广泛的CAS内容收集,重点介绍了有关冠状病毒相关治疗剂和预防性疫苗的全球研究与开发的已出版信息的概述。它概述了冠状病毒的形态,生物学和发病机理,并特别着重于涉及小分子药物的抗病毒策略,以及针对与冠状病毒感染和复制有关的复杂分子相互作用的生物制剂。本报告中概述的重新利用药物的工作主要集中于目前已知对其他RNA病毒(包括SARS-CoV,MERS-CoV,流感,HCV和埃博拉病毒)有效的药物以及抗炎药。生物制剂对冠状病毒感染的潜在影响是有前途的,并且包括多种选择,包括生物工程和载体化抗体,细胞因子以及针对病毒基因表达的基于核酸的疗法以及各种类型的疫苗

本报告中提供的信息为正在进行的研发工作提供了强大的知识基础,以发现和开发用于治疗COVID-19和冠状病毒相关疾病的治疗剂和疫苗。 由于篇幅所限,本报告仅关注于当前工作,这些工作涉及推进更有效和准确的COVID-19诊断方法和产品

RNA病毒引起的新型传染病会受到突变和基因重组,以及跨物种传播,将继续构成严重的全球健康威胁,例如COVID-19。 尽管以前曾发生两次严重的冠状病毒感染大爆发并导致SARS和MERS呼吸系统疾病,但世界对有效管理当前COVID-19疫情的准备不足,事实证明,COVID-19已导致全球数千人死亡

为减少对人类生活和全球医疗系统的压倒性影响,有必要共同努力,开发出有效药物和疫苗,以应对现有和潜在的未来冠状病毒感染以及其他高致病性病毒爆发。鉴于临床药物开发涉及昂贵且艰巨的过程,COVID-19的爆发进一步凸显了开发相对广谱的抗病毒药物的价值,以及应用创新方法(如人工智能)促进药物发现的重要性。考虑到新药开发的漫长过程,当前的重新利用药物策略已成为立即治疗SARS-CoV-2感染者的选择解决方案之一。制药行业的长期药物开发目标包括确定针对与SARS-CoV-2或其他相关冠状病毒相关的复制或感染过程的抑制剂,以及其感染导致严重疾病和/或死亡的症状结果。本报告中包含的小分子化合物的摘要列表,以及具有适合于抑制几种关键冠状病毒蛋白特性的生物制剂的其他说明,可以用作药物开发的信息起点。由于疫苗对于将来预防与冠状病毒有关的流行病至关重要,因此可以放心的是,已经部署了许多创新策略。四种MERS冠状病毒DNA疫苗候选药物于2019年9月开始一期临床试验56,而Moderna Inc.于2020年2月发布了第一批mRNA-1273,这是一种针对SARSCoV-2的mRNA疫苗,准备在美国进行相研究。

在抗病毒发现过程和临床试验性能方面的进一步合作将增加患者获得具有改善治疗潜力的候选药物的机会,并理想地减少将这些药物推向市场所需的时间。 如本报告所述,与SARS-CoV-2病毒相关疾病暴发相关的大量出版物和快速发表率表明,研究机构和制药行业为解决有用的分子机制和治疗途径付出了巨大的努力, 用于治疗当前和未来的冠状病毒爆发

参考资料

  • Research and Development on Therapeutic Agents and Vaccines for COVID-19 and Related Human Coronavirus Diseases
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