【2.15.3】冠状病毒治疗策略

receptor-binding domains (RBDs)

一、背景介绍

新冠病毒致病机制与SARS类似,以病人细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)为主要入侵受体。具体而言,新冠病毒感染人体后,利用病毒表面的Spike糖蛋白(刺突糖蛋白,简称S蛋白)识别ACE2后侵染目标细胞。

全长ACE2由一个N末端肽酶结构域(PD,peptidase domain ),一个以单个跨膜螺旋和一个约40个残基的细胞内区段结尾(13,19)的C末端Collectrin样结构域(CLD,Collectrin-like domain)组成,。

ACE2是一种金属蛋白酶,作用是催化血管紧张素I降解成血管紧张素(1-9)九肽,或血管紧张素II降解为血管紧张素(1-7)七肽,被认为可以参与调节心血管功能并可能在急性肺损伤中具有保护作用。

肾素-血管紧张素系统(RAS,renin-angiotensin system)调节多种组织中的血管紧张度和流体电解质稳态[1-4]。

  • 血管紧张素转换酶(ACE, angiotensin-converting enzyme)将血管紧张素I(Ang I,Angiotensin )的活性形成的血管紧张素II(Ang II),是RAS的关键效应肽,并通过I型血管紧张素受体(AT1R)介导生理作用, 包括血管收缩,炎症,细胞凋亡,毛细血管渗漏和纤维增生[5-8]。
  • ACE2是一种膜结合的羧肽酶,可将Ang II水解为七肽血管紧张素-(1-7)(Ang 1-7)。 ACE2可以直接通过减少Ang II / AT1R信号来调节RAS信号,也可以通过激活反调节性Ang 1-7 / Mas受体途径间接调节RAS信号[9-12]。

RAS信号和ACE2已与急性呼吸窘迫综合征(ARDS) 的发病机制有关。 缺乏ACE2的小鼠在受到各种侮辱攻击(insults)后发展为严重的急性肺损伤(ALI)[13,14],通过补充重组ACE2可以改善[15]。 ARDS患者和败血症患者中ACE和Ang II的水平升高表明ACE / Ang II信号在人类疾病中的重要性[16-19],而插入/缺失的遗传研究进一步强调了这一点(I / D)ACE基因内的多态性,D等位基因赋予组织和血清更高的ACE和Ang II水平[20]。 许多研究和荟萃分析[20-23]表明ACE D等位基因与ARDS队列死亡率之间存在关联。

在脂多糖诱导的ALI仔猪模型中,人ACE2催化胞外域的重组形式(rhACE2,GSK2586881)减轻了动脉血氧不足[24],并且对健康人类志愿者给药具有良好的耐受性[25]。 我们推测在ARDS患者中添加外源性ACE2可以减轻肺损伤而不损害全身血流动力学。 我们报告了GSK2586881在ARDS机械通气患者中进行的前瞻性,安慰剂对照试验的结果。 该试验的目的是为重症患者建立初步的安全性,药代动力学(PK)和药效学(PD),并探讨GSK2586881对ARDS相关生理指标的影响。

血管紧张素转换酶(ACE2)是肾素-血管紧张素系统中的关键酶。 它以羧肽酶的形式锚定在膜上,并主要在肺,肾和心脏细胞中表达为受体,但在内皮细胞上也表达,并裂解各种肽底物。 底物的突出代表是血管紧张素II(Ang II,Angiotensin),其被切割为血管紧张素1-7(Ang 1-7),血管紧张素I,其被切割为血管紧张素1-9,以及apelin和缓激肽(bradykinin)。 Ang II和Ang 1-7是肾素-血管紧张素系统的拮抗剂。 通过控制肽比例,ACE2负责调节血管厚度和内皮通透性,从而影响生物体的稳态。 ACE2的表达受制于动素(Zytokine),尤其是在各种炎症性疾病中均降低,随后导致Ang II的病理富集,Ang II是ACE2最重要的底物之一。

ACE2用于治疗ARDS或ALI,这是两种急性肺疾病,与肺中ACE2表达下调有关。 该疗法使用重组可溶人ACE2,其可全身施用,并且对于整个生物体都是非常迅速可用的,以降低Ang II的浓度升高,从而产生Ang 1-7。 这补偿了Ang II浓度增加的负面影响。 在这种情况下,将需要提供具有合适药理学特性的产品:因此,合适的物质的特征在于在生物体内的良好分布,药理学上有用的半衰期以及低免疫原性。 特别地,该产物必须是酶活性的,具有良好的溶解性并且还必须在溶液中稳定,并且能够以高纯度可再生且经济地生产。

Tipnis等人(J Biol Chem 275,(43)(2000):33238-43)描述了ACE2的分离(在这种情况下仍称为ACEH)及其cDNA的分离。通过在CHO细胞中进行生产,生产了分子量为120kDa的糖基化蛋白单体。去糖基化后,该蛋白质的质量为85 kDa。

Donoghue(Circ Res 87,(5)(2000):1-9)描述了可溶性ACE2在CHO细胞中的表达。它没有被完全糖基化,并且被表征为具有大约90 kDa的分子量。此外,该文献涉及各种ACE2序列和抗ACE2抗体的序列比较。

WO2004 / 023270A2描述了在Sf9昆虫细胞中表达ACE2单体后ACE2的结晶。经质谱分析后,该蛋白质的分子质量为89.6 kDa。

有效的酶替代疗法的治疗作用需要一种生产过程,该生产过程可以经济且可重复地生产出非常纯净的,药理学上有效的产品。 ACE2的可溶性细胞外部分含有7个N-糖基化位点。 非糖基化的ACE2的溶解度低,趋于聚集,具有更高的免疫原性并缩短了半衰期。 另外,它具有较小的流体动力学直径,这主要对纯化有不利影响。 因此,本发明的一个目的是提供具有良好的体内半衰期的高活性ACE2。 该目的通过权利要求的主题来实现

因此,例如,参考Vickers等人的Towler等人(J Biol Chem 279(17),2004:17996-18007),描述了ACE2在Sf9昆虫中的表达(JBiol Chem 277(17),2002:14838-14843)。 纯化后,将大小排阻色谱纯化后的单体细胞作为最终纯化步骤。 单体的分子量为89.6 kDa。

为了稳定根据本发明的治疗剂,根据本发明,已经开发了一种方法,其仅产生稳定的ACE2二聚体,并且与ACE2单体相比,其在生产和药理上均受益。

二聚化具有以下优点:

  1. 在生理溶液中具有更好的溶解度和生物利用度:二聚体具有较高的溶解度,并具有更长的体内半衰期和利用度;
  2. 没有聚集体形成:ACE2二聚体形成稳定的复合物,而无需在二聚体中添加其他ACE2分子;
  3. 减少蛋白酶的攻击:由于单个蛋白质部分以及最可能的C末端部分都指向二聚体的内部,因此该C末端不会降解;
  4. 半衰期增加:较低的免疫原性,更好的溶解度和对蛋白水解降解的敏感性降低,从而增加了蛋白质的半衰期;
  5. 简单的蛋白质纯化:由于其结构和明显的溶剂化鞘,ACE2二聚体的流体动力学直径比预期的高。 因此,通过使用大小分离柱,可以轻松地将ACE2二聚体与蛋白质表达产生的常规杂质(例如血清白蛋白(67kDa))分离。

优选地,重组ACE2多肽在至少80%的可能的N-糖基化位点上被糖基化,并且糖的比例大于10%(占总ACE2的重量%)或11%,12%,13%,14%, 优选大于15%或16%,17%,18%,19%,特别是大于20%或21%,22%,23%,24%或25%。

已经开发了一种生产方法,该方法可重复生产非常纯且具有酶活性的高度复杂的糖基化ACE2。 该产品的特点是糖含量高(按重量计> 20%)和复杂的,高度分支的,部分带负电荷的糖结构。 这些对产品的溶解度,生物利用度,酶活性以及药理特性具有积极影响。 通过选择合适的表达构建体,合适的表达宿主,优化的选择策略,使用针对细胞代谢以及艰苦的克隆分析和选择而专门设计的培养基,已经能够生产出分泌所需产物的细胞系 。

ACE2已在Sf9昆虫细胞和NS0小鼠细胞中表达。 该材料主要用于体外试验。 还存在关于CHO细胞中ACE2瞬时表达的结果。 迄今为止,还没有以合适的高生产率生产细胞系。 此外,关于产品的性质,特别是关于N-糖基化,尚未进行相应的克隆选择。

蛋白质的溶解度不仅取决于其氨基酸序列,还取决于其折叠以及翻译后修饰。 带电荷的糖结构是蛋白质溶解度增加的主要原因,并且对其药理学特性有重大影响。 因此,对于EPO已经表明,复杂的分支糖结构的存在对该蛋白的半衰期具有积极作用。

原则上,可以考虑各种表达系统用于ACE2的重组表达。 由于缺乏N-糖基化位点的加工,因此未进一步测试原核宿主细胞。

优选地,至少70%的糖基化N-糖基化位点具有彼此独立地选自式1至8的结构:

优选地,ACE2多肽不具有跨膜结构域。 因此,它是可溶的ACE2。 因此,特别优选的实施方案包括可溶性ACE2多肽,其多肽链由氨基酸18-740或其酶活性片段组成。 另一多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸18-615组成

二、药物开发策略

而对于组成蛋白较少病毒,常见的抗体开发思路是阻断病毒表面蛋白与入侵受体间的结合。如以抗埃博拉抗体组合Atoltivimab + Odesivirmab + Maftivimab一战成名的再生元Regeneron(相比于小分子RNA合成干扰制剂Remdesivir组29%的埃博拉感染患者死亡率,抗体组合组死亡率为9.9%,预计今年获FDA上市批准),其开发的抗中东呼吸综合症(Middle East Respiratory Syndrome, MERS)抗体目前正处于临床I期,就是通过阻断MERS病毒刺突蛋白与入侵受体二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4, DPP4)间的结合发挥功能。而其他公司研发的针对SARS冠状病毒的抗病毒抗体也大多围绕阻断SARS冠状病毒与ACE2结合展开。

策略1:Developing neutralizing antibodies to 2019-nCoV

冠状病毒的进入始于S蛋白与细胞表面靶受体的结合,融合后在细胞膜上介导,将病毒核衣壳传递到细胞内以进行后续复制。 S蛋白以引起感染细胞与周围其他受体细胞之间的合胞体形成而闻名,强调S蛋白仅在病毒体状态下不起作用

针对2019-nCoV表面的S蛋白的中和抗体可能是学术界和工业界生物医学研究人员考虑的第一种疗法,可提供对疾病的被动免疫。最近发布的2019-nCoV基因组序列(GenBank:MN908947.3)使研究人员可以在实验室中进行基因合成并考虑将S蛋白表达为免疫原。对于这次暴发,筛查小鼠或兔子以中和抗体的传统方法可能太慢了,但是可以使用快速的方法(例如使用表达抗体片段的噬菌体或酵母菌展示文库)来快速识别病毒中和的候选候选物。挑战在于,任何候选抗体都需要在细胞培养和动物模型中进行严格测试,以确认其可以中和2019-nCoV并预防感染。此外,将需要测试在人群中传播的几种分离株,以尝试评估中和抗体是否获得足够的覆盖范围。来自其他冠状病毒物种(如SARS)的信息将有助于确定在哪里靶向最佳表位以产生中和抗体(S蛋白中的受体结合结构域是关键靶标),但这再次是一个缓慢而富挑战性的过程,可能几个月都不会产生明显的收益。而且,最终可能需要抗体混合物以确保对患者的完全保护,这将增加制剂和制造的额外复杂性。像下面讨论的一些治疗选择一样,在低级生物体中表达任何先导候选物以表达蛋白质(细菌,酵母,昆虫细胞)的能力将有助于为患者更快地生产疗法

产生针对2019-nCoV S蛋白的中和抗体的另一种策略是用2019-nCoV S蛋白免疫大型动物(绵羊,山羊,牛),然后从动物中纯化多克隆抗体20。 该策略可在爆发时提供快速服务,并具有许多优点,例如简化生产和制造,但有限地保证了每只动物都会产生中和性抗血清,或每只动物的抗体效价是多少。 此外,还有针对其他物种的针对外来免疫球蛋白的人类免疫反应,这可能会使任何治疗方案变得复杂。 在真正绝望的情况下,此策略可能在短期内可行,但在2019-nCoV爆发中难以轻易扩大规模,该爆发已经迅速成倍增长

策略2 :使用针对2019-nCoV RNA基因组的寡核苷酸

除了靶向2019-nCoV的表面蛋白外,还可以靶向RNA基因组本身进行降解。 2019-nCoV的这种RNA基因组序列最近已发布(GenBank:MN908947.3),然后可以考虑的一种策略是使用小干扰RNA(siRNA)或反义寡核苷酸(ASO,antisense oligonucleotides)通过靶向来对抗病毒它的RNA基因组。这种策略的挑战是多重的。

  1. 首先,CoV-2019的保守RNA序列结构域未知。为了优化siRNA靶向并避免寡核苷酸策略的病毒逃逸,鉴定保守序列至关重要。可以通过观察2019-nCoV与SARS病毒的基因组同源性来比较保守序列,但这仍然是猜测。

  2. 第二个挑战是如何将寡核苷酸递送到肺中。诸如脂质纳米颗粒之类的可介导一些向肺部输送的输送媒介已经取得了进展24。但是,是否能在肺部有效地传递足够的siRNA或ASO来阻止感染或改变其临床进程尚不明确。例如,如果肺中25%的肺泡上皮细胞中含有siRNA或ASO,那么这种效率对于传统的基因治疗可能是巨大的成功,但几乎不会对病毒感染产生任何影响。

尽管临床前动物模型取得了巨大成功,但这种解释也可能解释了抗埃博拉病毒的siRNA候选物为何在试验中失败的原因。 最后,即使人们认为siRNA在临床上是有效的,将siRNA药物的生产规模扩大到大量感染人群的能力仍然有限。当前的siRNA和ASO治疗方法是针对罕见疾病而生产的,并且没有可用的资源来快速制造药物。

策略3 Repurposing currently available antiviral medications 重新利用当前可用的抗病毒药物

2019-nCoV的理想药物将被批准为小分子药物,可以抑制病毒生命周期的不同方面,最终抑制复制。病毒聚合酶和蛋白酶(polymerases and protease )抑制剂是两类潜在的靶标,它们都是人免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV,hepatitis C virus)抗病毒方案的组成部分。绝望的临床医生已经在进行各种不同用途的抗病毒药物的临床试验研究。除病例报告之外,以前在每次病毒爆发中都取得了成功,但效果有限。确实,在埃博拉疫情爆发期间,没有明确显示可重新使用的小分子药物能够改善所有患者的临床病情。 2019-nCoV可能有所不同,并且有初步的积极报告表明:

  • 洛匹那韦和利托那韦(lopinavir and ritonavir)是HIV蛋白酶抑制剂,对2019-nCoV具有一定的临床疗效,类似于先前针对SARS使用它们的研究。应继续进行研究以筛选2019-nCoV细胞培养模型中其他临床可用的抗病毒药物,希望候选药物对这种可在临床中迅速实施的病毒有用。 * Remdesivir是一个很有前途的例子,它会干扰病毒聚合酶并在小鼠模型中显示出抗MERS的功效。为了获得更多信息,提供了以前对冠状病毒的药物再利用努力的综述。

尽管这些改头换面的药物可能抱有希望,但继续采用新颖的2019-nCoV特异性疗法来补充潜在的改头换面药物仍然是合理的

策略4 恢复期患者血清的被动抗体转移 Passive antibody transfer from convalescent patient sera

可用于传染病暴发的一种简单但可能非常有效的工具是使用从病毒中恢复的患者血清来治疗将来感染该病毒的患者。解决了病毒感染的患者将对2019-nCoV的不同病毒抗原产生多克隆抗体免疫反应。这些多克隆抗体中的一些可能会中和病毒并阻止新一轮的感染,而感染被治愈的患者应产生高滴度的2019-nCoV抗体。

解决2019-nCoV病例的患者可以简单地捐赠血浆,然后可以将这种血浆输注到感染的患者中37。鉴于血浆捐赠已得到充分确立,血浆的输注也是常规医疗保健,因此该建议不需要任何新的科学或医学批准即可实施。实际上,在2014-2015年爆发期间,对数名恢复期血清埃博拉病患者的治疗也采用了相同的理由,其中包括两名被感染的美国医护人员

随着疫情的继续发展,将有更多幸存的感染患者可以作为捐助者为2019-nCoV制备抗血清,并且可以开发大量抗血清来治疗最病的患者。 不幸的是,爆发的指数增长将不利于该策略,因为病例数的增加可能会超过先前患者提供供体血浆治疗的能力。 此外,恢复期患者的血清在抗病毒作用的效力方面会有很大的差异,使其不太理想。 虽然输血服务现在当然应该将恢复期患者的血清作为患者治疗的一种选择,但最终限制了其控制暴发的有效范围

策略5 新的2019-nCoV疗法提案 Proposal for new 2019-nCoV therapies

爆发期间与2019-nCoV对抗的最简单,最直接的方法是中和病毒进入细胞的功能,抗体通常在体内发挥作用39。 由于上面讨论中和抗体时提到的原因,很难快速验证广泛的中和抗体,并且要确保突变的RNA病毒不会逃脱其中和是一个挑战。 可以采用鸡尾酒抗体方法进行治疗埃博拉大流行的研究,但会增加制造过程的复杂性。

但是,在这种情况下还有另一种策略可以使用,它不依赖于直接靶向病毒糖蛋白。在这种策略中,可以通过将病毒受体蛋白靶向细胞表面来获得中和作用,从而阻止病毒与其结合并进入。幸运的是,科学家们已经在细胞培养中发现了病毒受体的身份。最近的预印本出版物发现,2019-nCoV使用血管紧张素转化酶2(ACE2)作为细胞进入的受体41,该受体与SARS冠状病毒用于进入的受体相同42。对于这两种病毒,冠状病毒都通过其在病毒体上的S蛋白与ACE2结合,之后病毒膜和细胞膜融合。随后,RNA病毒将在细胞内复制其基因组,并最终产生新的病毒粒子,这些病毒粒子将被分泌以感染其他细胞。使用ACE2受体的SARS和2019-nCoV的巧合为利用广泛研究SARS进入的研究并将其应用于2019-nCoV开辟了可能性。根据SARS文献,可以考虑几种潜在的阻断策略,这些策略在防止SARS模型中有效预防感染

与ACE2受体结合的阻断剂

第一种策略将包括对患者给药与ACE2结合的药物。 此处的主要优势是宿主ACE2蛋白不会改变,因此无需担心会脱离治疗剂。 而且,在这种暴发的时间范围内,该病毒将无法突变并结合一个全新的宿主受体。 这种功能关系是通过长期发展而建立的。 以此类推,流感病毒每年都会改变其表面的突变以逃避抗体的中和,但它始终致力于利用细胞表面的唾液酸作为进入受体。

有两种已知的代理(agents)绑定到ACE2的选项。

  1. 首先是使用来自SARS S蛋白的小受体结合结构域(RBD),该蛋白已被证明是在进入过程中与ACE2受体结合的关键结构域44。已显示对该域大小为193个氨基酸的管理可有效阻断SARS在细胞培养中的进入。可以将SARS RBD给予患者,从而将其ACE2蛋白结合在靶细胞上,从而防止感染,这完全是有原因的(图1)。也有可能产生与2019-nCoV相当的RBD并将其用作疗法。该策略假设SARS和2019-nCoV在ACE2上具有相同的结合位点,考虑到SARS和NL63冠状病毒的相似ACE2结合位点,则很有可能。该疗法的小规模(与骆驼科动物抗体的纳米抗体域大小相似)将增强将生物制剂灌注到组织中以更有效地结合病毒进入受体。关于持续的暴发情况,这种小蛋白潜在地促进了细菌中该疗法的快速生产,这将有助于提高产量。此外,细菌生产将使RBD蛋白在当今中国广泛的生产设施中生产,而该工厂已经有众多合同研究组织运营。
  2. 备选地,RBD蛋白可以连接至Fc片段以延长循环,这对于来自MERS的等效212个氨基酸结构域进行。 MERS RBD-Fc融合蛋白具有阻断病毒感染细胞受体的能力,并能激发针对小鼠特定病毒结构域的免疫反应。值得注意的是,由于RBD-Fc融合体会结合正常细胞,因此人们希望通过消除Fc受体结合的突变消除细胞毒性Fc结构域功能

第二种类似的策略是施用可与ACE2蛋白结合的抗体,从而预防2019-nCoV感染(图1)。实验证明,该策略可有效阻止SARS进入和复制。尽管没有ACE2抗体序列在文献索引中公开,但确实存在单克隆抗体,并且相关的杂交瘤序列可以在数天内被克隆。不会有任何病毒从ACE2结合抗体中逸出,这比针对S蛋白的中和方法具有优势。在考虑如何采用ACE2抗体策略时,有两个设计注意事项。任何效应子功能都需要从Fc结构域中去除,从而不会在表达ACE2的不同组织中引起炎症。这将保留Fc结构域赋予的半衰期,而没有任何副作用。包括Fc域的缺点是需要使用更昂贵的哺乳动物细胞生产系统来保留适当的糖基化,这将减少在暴发情况下将药物运送给患者的周转时间。或者,可以只管理与ACE2结合的单链可变片段(scFv)。来自骆驼科动物的纳米抗体或VHH结构域也是另一种选择50,51。它们可以在细菌中产生,并且其体积小将允许快速渗透到不同的组织中。不利的一面是这些没有Fc结构域的分子的半衰期较短

这两个选项有几个限制。关于SARS RBD策略,尽管与2019-nCoV对抗的关键感染干预期将在此时间范围内,但机体最终可能会对SARS蛋白产生免疫反应,之后两种病毒都将产生免疫反应。或者,如果要使用2019-nCoV本身的同源RBD,则这种免疫应答可能会非常有利,因为它既可以产生阻断作用,又可以产生疫苗接种作用。对于这两种策略,未知人体中跨不同器官阻断ACE2受体所需的剂量,以及为了减缓感染而需要饱和的ACE2受体的百分比也未知。在肺和胃肠器官以及其他组织中的血管内皮细胞中发现的体内ACE2受体的数量最终可能被证明对该策略不利。此外,细胞表面ACE2受体的更新也将影响治疗性蛋白质的施用频率。为了解决这个问题,可以通过雾化对肺部局部给药,提高肺部感染关键部位抗ACE2治疗的浓度。最后,这两种策略都有可能直接结合ACE2,这反常地使肺生理变差,阻断不同器官中的ACE2受体在体内的阻断剂量以及未知的ACE2受体百分率均未知为了减慢感染速度。机体中ACE2受体的数量(在肺和胃肠器官中以及在其他组织中的血管内皮细胞中发现)最终可能被证明对该策略不利。此外,细胞表面ACE2受体的更新也将影响治疗性蛋白质的施用频率。为了解决这个问题,可以通过雾化对肺部局部给药,提高肺部感染关键部位抗ACE2治疗的浓度。最后,直接结合ACE2可能反常地恶化肺部生理机能

ACE2免疫粘附素策略 ACE2 immunoadhesin strategy

潜在的更有希望的策略是创建与冠状病毒本身结合的抗体样分子,而不是保护细胞不被感染。对于此策略,建议使用可溶形式的ACE2受体,该受体可与2019-nCoV的S蛋白结合,从而中和病毒(图1)。同样,对SARS病毒的研究表明,这种策略具有潜在的前景。可溶性ACE2受体被证明可以阻止SARS病毒感染培养物中的细胞。可溶性ACE2对SARS S蛋白的亲和力据报道为1.70 nM,与单克隆抗体的亲和力相当。 2019-nCoV对ACE2的相似度可能很高。为了将ACE2用作治疗患者的治疗方法,建议将可溶性ACE2转化为与免疫球蛋白Fc结构域(ACE2-Fc)融合的免疫粘附素形式,从而延长循环分子的寿命,同时还募集效应子功能对病毒的免疫系统。尽管未在动物模型中进行测试,但先前的研究表明,与人IgG1域融合的ACE2细胞外域(ACE2-NN-Ig)在体外中和SARS冠状病毒方面有效,抑制浓度为2 nM56,抑制率为50%。这项研究然后提供证据表明ACE2-Fc可以在体外和潜在地在患者中同样抑制2019-nCoV

使用ACE2作为2019-nCoV S蛋白中和剂的另一个优势是ACE2给药也可以直接治疗肺炎的病理生理学。一部分SARS和2019-nCoV感染患者会出现肺炎,其特点是肺水肿和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)1,2。病毒可能部分通过病毒诱导的ACE2蛋白脱落和ACE2蛋白表达降低而引起ARDS,二者均由S蛋白结合介导54。重组ACE2蛋白的给药已显示可通过降低血管紧张素II水平和随后与血管紧张素II 1a型受体结合的激素来改善急性肺损伤57。重组ACE2还可以减少呼吸道合胞病毒58和H5N1流感59感染模型中的ARDS。基于这些有前途的临床前研究,重组人ACE2(rhACE2)已进入临床试验,以治疗重症患者的ARDS。一期临床试验表明,rhACE2具有很好的耐受性,对心血管系统无影响60。一项II期临床试验显示了降低Ang1-8肽水平的靶标疗效,但未显示呼吸参数的显着调节61。在动物模型中,rhACE2给药是否具有与治疗ARDS相同的临床益处还有待观察,以及在2019-nCoV患者中,ACE2-Fc给药是否可以缓解ARDS。

针对2019-nCoV患者的拟议疗法将包括与人免疫球蛋白G Fc结构域融合的ACE2蛋白的细胞外结构域(图2A)。 研究表明,ACE2的18至615位氨基酸似乎足以抵抗SARS S蛋白的结合,它也涵盖了ACE2酶功能所必需的肽酶结构域。 尽管较小的版本缺乏有益于治疗肺损伤的酶活性,但较小的一部分细胞外ACE2结构域可能足以与S蛋白结合。 需要进一步的研究来定义2019-nCoV S蛋白结合所需的最小ACE2结构域,以构建更小的ACE2-Fc蛋白。 尽管我们尚不知道2019-nCoV S蛋白的结构或其如何与ACE2受体结合,但现在可以合理地假设SARS病毒利用的相同ACE2蛋白结构域也被2019-nCoV结合到 感染细胞。

Fc结构域的优势是延长了药物的半衰期,这可以使医护人员在见到感染患者之前可以预防性地给予药物剂量。实际上,在一项评估高血压治疗的研究中,重组ACE2的半衰期在小鼠中格式化为重组ACE2-Fc治疗后,从不到两小时延长至超过一周。与先前的阻断剂策略的不同之处在于,Fc结构域的效应子功能可以保留在该分子中,从而允许树突状细胞,巨噬细胞和天然杀伤细胞通过CD16受体抵抗病毒颗粒或感染细胞。这可以促进宿主抗病毒免疫应答的更快激活和病毒的清除,这在SARS小鼠模型中得到了证明,其中与单独中和病毒的抗体相比,Fc结合抗体通过吞噬细胞的激活在消除SARS方面更有效。总体而言,ACE2-Fc融合蛋白具有与传统中和抗体相同的优点,可被视为治疗感染的方法,但由于2019-nCoV无法逃脱其中和作用,因此具有最大的广度和效力,相同的蛋白质也是细胞进入的受体。实际上,已经表明SARS与较轻度的人冠状病毒NL63的致病性与NL63对人ACE2相对于SARS的亲和力较低有关,其中NL63 S蛋白降低的ACE2水平低于SARS S蛋白。因此,如果2019-nCoV试图通过降低亲和力逃避ACE2中和,它将突变为病原性较低的病毒。这类似于2003-2004年的SARS再生病毒,该病毒对人ACE2的亲和力较低,导致严重程度较低的感染,没有二次传播。因此,当面对潜在的ACE2-Fc治疗时,2019-nCoV可能会出现进化陷阱,从而导致更良性的临床过程

为了给受体免疫粘附素作为一种潜在的抗病毒策略提供更多的支持,应该注意的是,CD4-Fc或CD4-IgG是发展为一种潜在的HIV药物的早期药物之一。该蛋白质包含CD4受体的前两个结构域,已知这两个域与感染的HIV细胞表面上的gp120结合。已显示CD4-IgG可在体外中和HIV,从而防止感染。尽管只有有限的轻度临床获益,但该蛋白在患者中给药仍是安全的68,69。已开发出更新的CD4-IgG增强版本,其还具有衍生自共受体CCR5的小肽,可增强亲和力并提供更强的中和活性,基本上可分离100%的HIV,并使猕猴对多种猿猴具有抗性。人类免疫缺陷病毒的挑战。尽管HIV和2019-nCoV是非常不同的病毒,具有不同的细胞类型,动力学和临床过程,但先前的HIV结果令人鼓舞,这可能是2019-nCoV的治疗策略。如果有的话,2019-nCoV可能更适合这种中和疗法,因为与HIV不同,呼吸道病毒只会引起急性感染,而HIV会在具有不同细胞库的宿主中引起慢性感染。

ACE2-Fc策略的一个潜在局限性是细胞外ACE2水平的升高可能对身体产生未知的影响,尤其是通过Fc域延长半衰期延长时间升高时。组织已经分泌了少量的细胞外ACE2,因此这种细胞外结构域的循环将不会是空前的。此外,重组ACE2蛋白在I期试验中对健康患者和肺损伤患者均具有良好的耐受性II试验表明,也可以耐受使用ACE2-Fc治疗2019-nCoV患者。如果仍然关注研究者,可以将ACE2肽酶活性的关键氨基酸突变,以消除该序列的天然功能,同时保留与SARS和2019-nCoV S蛋白的高亲和力结合。确实,以前曾在生成ACE2和IgG1融合蛋白时研究过这种可能性,这表明ACE2细胞外结构域的374和378位的组氨酸残基突变消除了肽酶活性,但保留了与SARS S蛋白结合的高亲和力。当然,ACE2肽酶突变可以消除ACE2重组蛋白递送对肺损伤的有益作用,因此建议首先保持ACE2酶的活性。另一个潜在的担忧是,通过抗体形式的受体结合可能会不经意地将2019-nCoV导向感染Fc受体(CD16)阳性细胞,这已在体外证明可中和MERS73中的抗体。目前尚不清楚这将具有什么临床意义,以及在体内将在多大程度上发生。最终,将需要临床试验来描述ACE2-Fc治疗的任何特定副作用

三、方案和计划

针对2019-nCoV的全球卫生工作的主要目标仍然是有效隔离患者并筛查可能被感染以限制传播的个人。该目标应继续向前。这里建议的是一种选择,至少可以快速给受感染的患者用药,以帮助缓解症状和预防死亡,同时继续为2019-nCoV开展疫苗工作。这可以通过ACE2-Fc提供三重作用机制来实现:(1)ACE2缺陷和肺损伤的治疗;(2)病毒中和;(3)免疫效应子募集。除了受感染的患者以外,ACE2-Fc还可以为处于危险中的医疗保健工作提供被动免疫。往前推荐中国和其他地区的医师,科学家和生物技术行业正在寻求立即生产ACE2-Fc生物制剂,并将其立即进行试验。可以使用各种不同的蛋白表达平台(CHO,昆虫,酵母),具体取决于特定合同制造商的专业知识。甚至可以考虑使用基因疗法从DNA或mRNA平台制造ACE2-Fc,但是可能会有不确定的递送策略,最终可能减慢治疗患者的进程

目标是ACE2-Fc可以治疗当前患者的感染,从而预防重大的发病和死亡,同时还可以作为潜在的预防手段,对一线临床医生以及可能接触该病毒的个人提供被动免疫 。 从本质上讲,ACE2-Fc可能是当今全球卫生界与2019-nCoV对抗所需的有效中和抗体,同时还可以治疗导致患者死亡的潜在ARDS病理生理。 它可以比恢复期的患者血清更快地缩放,恢复期的患者血清将取决于感染者的个人血清。 ACE2-Fc也将对病毒逃逸具有抵抗力,这与可能在未来几周至几个月内开发的潜在中和性单克隆抗体不同

尽管此处概述了治疗策略,但2019-nCoV研究的长期目标仍将是开发有效的疫苗以产生中和作用抗体,可能基于S蛋白,尤其是RBD蛋白。这样的试验应尽快进行,但可能难以获得正确水平的免疫原性,抗原呈递,佐剂添加和有效的抗体刺激。该病毒可能会继续变异,挫败了刺激保护性免疫的各种努力。相比之下,2019-nCoV无法逃脱ACE2-Fc的治疗策略,因为它利用自身的同源受体进行感染。如上所述,如果2019-nCoV试图通过降低ACE2亲和力结合来逃脱该疗法,则其病原性可能会降低,类似于SARS与人类冠状病毒NL6365的比较。最后,根据载体形式(例如病毒载体对mRNA对蛋白质),扩大任何有效疫苗的剂量也被证明是具有挑战性的,甚至是完全保护性的疫苗也不能帮助目前感染该病毒的患者。

为了帮助中国的研究人员和行业抗击2019-nCoV,提供了ACE2-Fc构建体的蛋白质序列(图2B)。 可以考虑使用不同的人Fc结构域(IgG1,IgG2,IgG3或IgG4),尽管IgG1传统上具有触发抗微生物反应的最大能力49。 类似地,也可以探索没有活性ACE2肽酶功能的ACE2-Fc生物制剂。 考虑到该序列的基因合成可以在一周内发生,因此可以在不久后将该基因置于所选的蛋白质表达平台内,从而快速产生蛋白质。 蛋白质A柱和行业中用于纯化抗体的其他技术的可用性将促进ACE2-Fc迅速重新用于中国现有的抗体生产基础设施。

最终追求ACE2-Fc的好处是,它可以有效地用作未来SARS和2019-nCoV暴发的治疗药物储备,以及将来使用ACE2受体进入人畜共患病库的任何新冠状病毒。此外,可以研究在中国和其他国家的动物中复制的冠状病毒,以评估其进入机制。通过了解这些动物中的其他动物,人们可以有效地预测一种可用于任何人畜共患病传播事件的受体,并在将来构建一种新的受体免疫粘附素分子。例如,基于该病毒使用的病毒受体DPP4,可以为MERS设想类似的免疫粘附素DPP4-Fc。除冠状病毒外,该策略还可以用于爆发风险高的其他病毒。在以前的临床试验工作的基础上,ACE2-Fc还可以用于治疗其他无关病毒和急性肺损伤原因的ARDS

总之,ACE2-Fc可能会成为当今医护人员治疗和预防2019-nCoV感染所需的中和抗体,并且如果基于可用序列的生产很快开始,ACE2-Fc可能在疾病爆发中发挥重要作用。 如果一个人希望在一分子中受体阻断和接种的双重功能,也可以寻求另一种2019-nCoV RBD-Fc融合。

该提案是一种生物制剂,可通过使用可溶形式的病毒受体血管紧张素转化酶2(ACE2)与免疫球蛋白Fc结构域(ACE2-Fc)融合来阻止2019-nCoV进入,从而提供中和抗体,最大程度地避免呼吸 任何病毒逃逸,同时还有助于募集免疫系统以建立持久的免疫力。 ACE2-Fc治疗还将补充感染过程中肺中ACE2水平的降低,从而将急性呼吸窘迫的病理生理直接作为第三种作用机制。

参考资料

  • https://mp.weixin.qq.com/s/Huv3tOqd-cExc-c0xmzONw
  • A pilot clinical trial of recombinant human angiotensin-converting enzyme 2 in acute respiratory distress syndrome
  • Therapeutic strategies in an outbreak scenario to treat the novel coronavirus originating in Wuhan, China [version 2; peer review: 1 approved]
  • Structure of dimeric full-length human ACE2 in complex with B0AT1
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