【2.2.2】NTS,ETS,ITS

  • NTS: non-transcribed spacer, also known as the intergenic region;
  • ETS: external transcribed spacer;
  • ITS: internal transcribed spacer

一、ITS

内部转录间隔区 (ITS) 是位于染色体中小亚基核糖体 RNA (rRNA) 和大亚基 rRNA 基因或多顺反子 rRNA 前体转录本中相应转录区域之间的间隔区 DNA。

在细菌和古细菌中,有一个 ITS,位于 16S 和 23S rRNA 基因之间。 相反,真核生物中有两个 ITS:ITS1 位于 18S 和 5.8S rRNA 基因之间,而 ITS2 位于 5.8S 和 28S(在opisthokonts,或植物中的 25S)rRNA 基因之间。 ITS1 对应于细菌和古细菌中的 ITS,而 ITS2 起源于中断祖先 23S rRNA 基因的插入

在细菌和古细菌中,ITS 以一到几个拷贝的形式出现,侧翼的 16S 和 23S 基因也是如此。 当有多个副本时,这些副本不会彼此相邻。 相反,它们出现在圆形染色体的离散位置。 在细菌中,在 ITS 中携带 tRNA 基因的情况并不少见。 [3] [4]

在真核生物中,编码核糖体 RNA 和间隔区的基因以数千个拷贝的串联重复形式出现,每个重复序列由称为基因间间隔区 (IGS,intergenic spacer ) 或非转录间隔区 (NTS,non-transcribed spacer ) 的非转录 DNA 区域分隔。

每个真核生物核糖体簇包含 5’ 外部转录间隔区 (5’ ETS)、18S rRNA 基因、ITS1、5.8S rRNA 基因、ITS2、26S 或 28S rRNA 基因,最后是 3’ ETS。

在 rRNA 成熟过程中,ETS 和 ITS 片段被切除。 作为这种成熟的非功能性副产品,它们会迅速降解。

每个真核核糖体簇包含 5’ 外部转录间隔区 (5’ ETS,external transcribed spacer)、18S rRNA 基因、ITS1、5.8S rRNA 基因、ITS2、26S 或 28S rRNA 基因,最后是 3’ ETS

Figure 1. Repeat unit of the 45S rRNA gene (tandemly repeated in human chr. 13, 14, 15, 21, and 22).

NTS: non-transcribed spacer, also known as the intergenic region; ETS: external transcribed spacer; ITS: internal transcribed spacer. rRNA transcription starts at the 5′ end of the ETS, with the first 414 nucleotides comprising the leader sequence. The non-coding (nc) r-RNA transcript is initiated upstream of the ETS.

在 rRNA 成熟过程中,ETS 和 ITS 片段被切除。 作为这种成熟的非功能性副产品,它们会迅速降解

在系统发育中使用

真核 ITS 区域的序列比较由于以下几个有利特性而广泛用于分类学和分子系统发育:[7]

  • 由于其与高度保守的侧翼序列的可用性相关的小尺寸,它被常规扩增。
  • 由于 rRNA 簇的高拷贝数,即使是少量 DNA 也很容易检测到。
  • 它通过不平等的交叉和基因转换经历了快速的协同进化。
  • 这促进了重复单元的基因组内同质性,尽管高通量测序显示植物物种内经常发生变异。 [8] 即使在密切相关的物种之间,它也具有高度的变异性。
  • 这可以通过作用于此类非编码间隔序列的相对较低的进化压力来解释。

例如,已证明 ITS 标记对于阐明以下分类群之间的系统发育关系特别有用。

众所周知,ITS2 比 ITS1 更保守。 所有 ITS2 序列共享一个共同的二级结构核心,[26] 而 ITS1 结构仅在更小的分类单元中保守。 无论保护范围如何,结构辅助比较都可以提供更高的分辨率和稳健性

真菌条码

ITS区域是真菌分子生态学中测序最广泛的DNA区域[28],已被推荐为通用真菌条形码序列[29]。它通常对物种到属级甚至物种内的分子系统学最有用(例如,识别地理种族)。由于其变异程度高于 rDNA 的其他基因区域(例如,小亚基和大亚基 rRNA),因此有时可以在 ITS 和 IGS 区域内观察到单个 rDNA 重复之间的变异。除了许多实验室使用的通用 ITS1+ITS4 引物 [30][31] 外,还描述了几种分类群特异性引物,可以选择性扩增真菌序列(例如,参见 Gardes & Bruns 1993 年描述担子菌 ITS 序列扩增的论文来自菌根样本)[32]尽管鸟枪法测序方法越来越多地用于微生物测序,但临床样本中真菌的低生物量使 ITS 区域扩增成为正在进行的研究领域

二、ETS

外部转录间隔区 (ETS) 是指一段无功能的 RNA,与内部转录间隔区( internal transcribed spacer )密切相关,位于结构核糖体 RNA (rRNA) 之外的共同前体转录本上。 [1] 生物体特有的 ETS 序列可用于追踪其系统发育

三、间隔DNA, Spacer DNA ,Intergenic spacer

间隔 DNA (Spacer DNA)是基因之间的非编码 DNA 区域。 术语基因间间隔区 (IGS,intergenic spacer ) 或非转录间隔区 (NTS,non-transcribed spacer) 特别用于表示核糖体 RNA 基因的许多串联重复拷贝之间的间隔区 DNA。 [3] 铁汉 17:29:58 在细菌中,间隔 DNA 序列只有几个核苷酸长。在真核生物中,它们可以是广泛的,包括重复的 DNA,构成了基因组的大部分 DNA。 [3]在核糖体 DNA 中,基因簇内部和基因簇之间存在间隔区(spacers ),分别称为内部转录间隔区 (ITS) 和外部转录间隔区 (ETS)。在动物中,线粒体 DNA 基因通常具有非常短的间隔区。在真菌中,线粒体 DNA 间隔区很常见且长度可变,它们也可能是可移动的。 [1]

由于间隔 DNA 的非编码性质,其核苷酸序列随时间的变化比编码受选择力影响的基因的核苷酸序列快得多。尽管间隔 DNA 可能不具有依赖于其核苷酸序列的功能,但它可能具有与序列无关的功能。 [2]

间隔 DNA 具有实际应用,使研究人员和科学家能够检查 CRISPR 蛋白和噬菌体之间的相互作用

Neurospora crassa rDNA NTS

核糖体 RNA (rRNA) 基因的非转录间隔区 (NTS) 区域是 rDNA 中最重要的区域,因为它包含触发和/或终止转录的核苷酸序列。为了了解粗糙脉孢菌 rDNA 的 NTS 区域的结构组织,我们克隆并测序了完整的 NTS 区域,并将其与来自其他生物的相应序列进行了比较。

一个 3592 核苷酸长的粗糙脉孢菌核 DNA 包含非转录间隔区和部分 26S rRNA(3’端)和 17S(5’端)被分离并克隆到质粒 pBR325(Chambers, C., S.K. Dutta and R.J. Crouch 1986. Gene 44:159)。该克隆,即 pCC3400,对氨苄青霉素和四环素具有抗性,对氯霉素敏感。

通过核苷酸测序的链终止方法确定的粗糙脉孢菌 rDNA 的完整 NTS 区域(包括 3592 nt)显示出许多重要特征,这些特征的简要说明如下:

  1. 与 NTS 区域(例如非洲爪蟾、人类、大鼠、小鼠等)中的其他 rDNA 序列一样,粗糙脉孢菌的 NTS 区域富含 GC(65% G+C)。

  2. NTS区存在rRNA加工位点6(表明克隆pCC3400含有26S rRNA编码区的3’端和侧翼序列),序列GGTGCGAGAACCCGGA(核苷酸残基226至240)类似于酵母、非洲爪蟾、小鼠和人类(但不是果蝇,其中核糖体 DNA 串联阵列的转录不会在任何固定点终止)报告的 rRNA 加工位点 6 的共有序列。

  3. NTS 区域到处都有长长的嘧啶,这种结构组织如果存在于玉米、小麦、萝卜、蚕豆、豌豆、黄瓜和水稻中。

  4. 转录终止位点,从传统的“SalI 框”开始,存在于粗糙脉孢菌的 NTS 区域,正如对小鼠和人类的报道。然而,与 NTS 区域的小鼠 rDNA 中的 8 个 SalI 框相比,粗糙脉孢菌中仅存在一个 SalI 框(从核苷酸 1469 到 1477)。来自不同来源的 SalI 框和相邻序列的序列比较表明,motif TCGAC 是共同的。

  5. 序列基序CTTCCT(从核苷酸残基512到517)显示与其pre-rRNA的人类转录终止位点T-2相似。

  6. 粗糙脉孢菌NTS 区的整体序列与酿酒酵母NTS 区的总体序列接近于人、非洲爪蟾、小麦、水稻、黄瓜、蚕豆、小鼠、大鼠和果蝇的NTS 区。

  7. 在粗糙脉孢菌的 NTS 区域,某些序列如 TCTC、TTTT 和 TTGC 重复多次。已经报道了人类 rDNA 的类似序列重复,尽管这些序列的功能意义尚未确定。

简而言之,本研究中获得的信息对于研究粗糙脉孢菌 rRNA 基因的转录调控非常有用,NTS 区域的保守序列可用于进化研究。使用本研究中表征的克隆 pCC3400 在体内和体外确定粗糙脉孢菌转录起始和终止位点,等待适当的实验设计的结果,因此是我们实验室的持续重点。整个序列正在其他地方发表,可应要求提供。

参考资料

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