【3.7.1】核酸的变性和复性

一、核酸变性

核酸在特定的理化因素的影响下,维系双螺旋结构的氢键和碱基堆集力受到破坏,分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构甚至解旋成单链的现象,称为核酸的变性。核酸的变性可以是部分的,也可能发生在整个核酸分子上,但是不涉及其一级结构即磷酸二酯键的断裂。

1.影响核酸变性的因素

凡能破坏有利于DNA双螺旋构象维持的因素(如氢键和碱基堆集力),以及增强不利于DNA双螺旋构象的维持因素(如磷酸基的静电斥力和碱基分子的内能)的都可以成为变性的原因,如加热、极端的pH、低离子强度、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破坏双螺旋结构引起核酸分子变性。如要维持单链状态,可保持pH大于11.3,以破坏氢键;或者盐浓度低于0.01mo1/L,此时由于磷酸基的静电斥力,使配对的碱基无法相互靠近,碱基堆集作用也保持在最低水平。

常用的DNA变性方法主要是热变性方法和碱变性方法。热变性使用得十分广泛,热量使核酸分子热运动加快,增加了碱基的分子内能,破坏了氢键和碱基堆集力,最终破坏核酸分子的双螺旋结构,引起核酸分子变性,A260的吸收值增大。因此,增色效应与温度具有十分密切的关系,热变性常用于变性动力学的研究。然而高温可能引起磷酸二酯键的断裂,得到长短不一的单链DNA。而碱变性方法则无此缺点,在pH 11.3时,全部氢键都被破坏,DNA完全变成单链的变性DNA。在制备单链DNA时,优先采取这种方法。

2.核酸因变性引起的理化性质的改变

变性能导致DNA溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构,变性后代之以“柔软”而松散的无规则单股线性结构,DNA粘度因此而明显下降。另外变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构象改变,使DNA溶液的旋光性发生变化。

变性还能提高DNA的浮力密度(buoyant density)。DNA、RNA和蛋白质这三种生物大分子都具有一定的密度,其中RNA的密度最大,蛋白质的密度最低,DNA的密度介于两者之间的某一个位置。一个特定的DNA分子的密度主要取决于它的GC含量和构象状态。GC含量越高,密度越大。与超螺旋结构存在的DNA密度显然要高于松弛状的DNA。而变性的DNA密度要高于没有变性的DNA。有一种特殊的离心方法叫密度梯度离心(Density gradient centrifugation),以CsCl盐溶液为离心液。离心管内的CsCl溶液在重力场的作用下,自管口至管底可自发形成由小到大的密度梯度。密度不同的生物大分子可以利用此方法被分开,而DNA一旦变性,其最后的位置会向下移,因为它的密度增加了。

变性时DNA溶液最重要的变化是增色效应(hyperchromic effect)。DNA分子具有紫外吸收的特性,其吸收峰值在260nm。DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础,但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。变性时DNA的双链解开,有序的碱基排列被打乱,增加了对光的吸收,因此变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强,成为增色效应。浓度为50ug/ml的双螺旋DNA的A260=1.00,完全变性的DNA即单链DNA的A260=1.37,而单核苷酸的等比例混合物的A260=1.60。

与蛋白质变性的不同的是,DNA不会因为变性而丧失生物学功能。这是因为DNA的生物学功能是以一级结构的形式贮存各种遗传信息,而变性并不影响核酸的一级结构。相反,变性有利于DNA的复制、转录和重组等。例如,在利用PCR进行体外扩增复制DNA的时候,第一步就是对模板DNA进行热变性。

  1. 紫外吸收增加(IncreasedUV absorbance)
  2. 浮力密度增加(Increased buoyant density)
  3. 黏度下降(Decreased viscosity)
  4. 生物学活性不受影响(Biological activity unaffected)

二、核酸的复性

变性DNA在适当条件下,两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象称为复性。热变性的DNA一般经缓慢冷却后即可复性,这个过程也称“退火”(annealing)。

热变性的DNA可以通过冷却来复性:

  1. 快速冷却:允许形成局部的双螺旋。(Rapid cooling: only allow partial renaturation of dsDNA).
  2. 缓慢冷却:可完全复性(Slow cooling: allow complete renaturation of dsDNA.
  3. 应用:杂交- 不同来源核酸分子上的互补序列可以配对结合(Application: Hybridization - renaturation of complementary sequences between different nucleic acid molecules)

复性并不是两条单链重新缠绕的简单过程。它首先从单链分子之间随机的无规则碰撞运动开始,当碰撞的两条单链大部分碱基都不能互补时,所形成的氢键都是短命的,很快会被分子的热运动所瓦解。只有当可以互补配对的一部分碱基相互靠近时,一般认为需要10~20bp,特别是富含G-C的节段首先形成氢键,产生一个或几个双螺旋核心。这一步称为成核作用(nucleation);然后,两条单链的其余部分就会像拉拉链那样迅速形成双螺旋结构。因此,复性过程的限制因素是分子碰撞过程。DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其他因素的影响。

1.温度和时间

一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件,越远离此温度,复性速度就越慢。在很低的温度(如4℃以下)下,分子的热运动显著减弱,互补链碰撞结合的机会自然大大减少。复性时温度下降必须是一缓慢过程,若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下),复性几乎是不可能的,因此实验中经常以此方式保持DNA的变性状态。

2.DNA浓度

复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”。这一过程进行的速度与DNA浓度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多,相互碰撞结合“成核”的机会越大。

3.DNA顺序的复杂性

DNA顺序的复杂性越低,互补碱基的配对越容易实现;而DNA顺序的复杂性越高,实现互补越困难。

参考资料

  • 南京大学 杨荣武老师 《结构生物学》课件
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