【3.2.2】AAV--一种用于哺乳动物基因表达的多功能病毒工具

腺相关病毒 (AAV)已成为研究和临床应用中最受欢迎的病毒工具。AAV 可用于在各种细胞类型中瞬时表达感兴趣的基因。它在大约 50 年前首次被描述为腺病毒制剂的污染物(contaminant of adenoviral preparations),因此得名(Atchison 等,1965)。 AAV 是一种单链 DNA 病毒,属于细小病毒科。它有一个包装在二十面体衣壳中的“简单”基因组。它没有脂质外壳,也称为包膜,因此不能支持在其表面添加糖蛋白,例如 VSV-G。在研究应用中,基因组通常会被切除,以便为基因传递和安全打开宝贵的货物空间。通过提供编码复制酶功能和衣壳蛋白的基因,您可以轻松地在组织培养环境中(即“反式”)补充病毒。这使研究人员能够在受控环境中产生更多病毒。尽管 AAV 是从多种生物体中分离出来的,但它与疾病无关,它被认为是生物安全 1 级 (BSL1) 病毒剂。

完美重组 AAV (rAAV,recombinant AAV) 工具的四个考虑因素

AAV 可用于多种应用,包括特定细胞类型中的瞬时基因表达、CRISPR 基因组编辑、光遗传学(optogenetics)和化学遗传学实验。如果您不熟悉使用 rAAV 作为基因传递工具,那么在开始之前您应该考虑以下一些事项:

1.载货量 Cargo capacity

即使是 rAAV 的内脏版本也有大约 4.7 kb 的载货容量,这是该病毒用于基因传递的主要限制之一。但是,如果您感兴趣的基因足够小,您可以设计包含两个基因的单个 rAAV 载体,并使用IRES 或 2A等元件从一个启​​动子共表达它们。如果滴度高,不同 rAAV 的共感染率也相当高,所以如果你不能将两个基因放在一个载体中,你可以共感染(尽管这在体内可能并不总是有效)。

2.特异性

有几种不同的 rAAV 成分可以驱动特定细胞/组织中的基因表达;这些包括启动子、Flp 或Cre依赖性基因开关和血清型(血清型将在下面详细讨论)。如果您的目标是广泛表达,那么具有广泛活性的启动子,例如 CAG(带有 CMV 立即早期增强子的鸡 β 肌动蛋白启动子,chicken beta actin promoter with CMV immediate early enhancer)是一个不错的选择。如果您有特定的目标细胞类型,您可能想尝试不同的启动子,例如用于神经元特异性启动子的 Camk2a。另一方面,具有 Cre 或 Flip 依赖性基因表达的 rAAV 载体可以注射到在特定细胞类型中表达 Cre 或 Flp 的动物体内,从而导致基因仅在这些细胞中表达。

3.血清型 Serotype

衣壳蛋白是非常重要的 rAAV 载体成分,并驱动这些载体的生物学。尽管多项研究表明不同血清型感染不同细胞类型的能力不同,但最近的一项研究表明,大多数(或所有)血清型使用相同的受体(AAVR)(Pillay 等,2016)。观察到的趋向性可能是由于其他因素造成的,例如病毒粒子与细胞表面的附着,或者可能是进入后的步骤,例如脱壳​​。

AAV 命名法可能会令人困惑。您可能会看到诸如 AAV2/2 或 AAV2/8 之类的名称,但这些数字实际上意味着什么?第一个数字代表反向末端重复 (ITR) 类型。ITR 是位于 AAV 基因组两侧的短 DNA 序列,并允许它在宿主细胞中形成串联体。它们与 Rep 蛋白一起促进在 19 号染色体上的 AAVS1 位点整合到人类基因组中,这仅在野生型 AAV 中观察到,而不是载体形式。几乎所有的载体都包含 2 型 ITR。2 型 ITR 可以与多种衣壳类型一起包装。用于包装 rAAV 载体的衣壳类型,即血清型,由第二个数字表示。例如,如果 rAAV 载体具有 2 型 ITR 和 8 型衣壳,则表示为 AAV 2/8。

4.基因组 Genome

野生型 AAV 是单链 DNA 病毒。DNA脱壳后,病毒依靠宿主细胞复制机制合成互补的DNA链。该步骤被认为是 rAAV 转导效率的限制因素。为了克服这个问题,(McCarty 等人,2001 年)通过突变一个 ITR 设计了一种二聚体或自互补 AAV(称为 scAAV, self-complementary, AAV)。scAAV 载体显示出比 ssAAV 快速起效(数天)和更高水平的转基因表达。然而,它们的包装容量 (<2.5Kb) 是 ssAAV (<4.8Kb) 的一半,限制了可以成功包装的基因和调控元件的数量。

如果您需要快速的转基因表达,scAAV 可能很有价值。较低的滴度可能能够达到所需的转基因表达水平,从而最大限度地减少由于高病毒粒子浓度而出现毒性或免疫原性的机会。

附注:您可以使用逆行 AAV ( retrograde AAVs) 来映射神经元连接。

生产您的 rAAV

在全国范围内有多个设施,您可以获得优质、高滴度的 rAAV(包括 Addgene!),但您也可以使用标准分子生物学工具和组织培养经验在您自己的实验室中生成 rAAV。

简而言之,首先用携带感兴趣基因的 rAAV 载体、腺病毒辅助质粒和含有 Rep 和 Cap 的质粒转染 HEK293T 细胞(图 2,通常称为“三重质粒转染”)。2-3 天后,您收集上清液(或在某些情况下制作细胞提取物,因为某些 rAAV 血清型被释放到培养基中,而其他血清型则不会)(Vandenberghe 等人,2010) 从中您可以使用聚乙二醇。然后使用高速超速离心机通过密度梯度离心进一步纯化病毒粒子。病毒粒子由于密度高会形成一条带,您可以从梯度中收集该带。然后通过透析/缓冲液交换去除密度梯度材料,如果需要,可以进一步浓缩病毒粒子。

可以使用针对病毒基因组和/或蛋白质凝胶的引物通过 qPCR 对病毒粒子制备物进行滴定(Veldwijk 等,2002)。这些滴度适用于物理颗粒,其中许多不具有传染性。物理颗粒与传染性颗粒的比率可以有很大差异,从 1 到 >100。

AAV 病毒粒子非常稳定。它们将经受住冻融循环和脱水,这使得可能在您的工作台、离心机或培养箱中的先前制备的污染成为可能。为了尽量减少这种情况,您应该使用消毒剂处理所有与 AAV 接触的一次性物品和表面,例如 Coverage Plus NPD。同样非常重要的是努力应用常见的细胞培养实践。

体内 rAAV 递送

根据您的生物系统,有几个与体内AAV 递送相关的因素会有所不同。这些因素极大地影响了感染的成功程度。无论您的应用是什么,下面列出了您在进行进样之前可能需要考虑的一些参数:

注射滴度:

您可以输送到组织的病毒颗粒数量将取决于您的病毒制剂的滴度和可以输送的最大体积,这非常重要。不幸的是,如上所述,物理粒子的滴度不能直接转化为您将在体内观察到的内容,尽管它是一个起点。您可以首先搜索文献以获取有关特定组织的建议,但通常需要通过尝试一系列稀释来在体内凭经验确定最佳剂量。

动物的年龄:

首先,重要的是要记住终末分化的细胞(即有丝分裂后细胞)将长期表达 AAV,但在分裂细胞中,表达将丢失。注射动物的年龄将决定您可以成功感染哪种类型的细胞。(即在早期发育时间点,尚未出生的细胞,即使它们的有丝分裂祖细胞存在,也不能被 AAV 感染)(Xiong 和 Cepko,2016)

感染的可视化:

在开始递送过程之前,您还应该考虑如何可视化您的 rAAV 感染。您是否在 rAAV 构建体中加入了报告基因,例如GFP 或 mCherry?这些将使通过荧光测量直接观察表达发生的位置变得容易。如果没有,您可以考虑共同注射一个 AAV,该 AAV 在驱动您感兴趣的基因的同一启动子下携带一个报告基因,并测量报告基因表达作为您感兴趣的基因的代理,这可能不容易检测。如果共表达或共感染是不可能的,那么通过免疫组织化学或原位杂交检测您的蛋白质可能是您最好的选择。

感染后时间:

在注射和组织处理之间需要足够的时间来检测 AAV 介导的基因表达。时间在很大程度上取决于衣壳类型和您感染的组织。等待约 2 周是许多组织的良好起点。据报道,AAV 介导的基因表达非常稳定,在人类临床试验和狗中持续数年(Wonjo 等人,2013 年)

AAV 是一种非常通用的病毒基因传递工具。您特定研究应用的需求将决定 AAV 设计和交付的适当参数。尽管您最终的血清型/滴度/年龄确定将在很大程度上依赖于试点实验,但您可以查看不断增长的文献,以获得适用于许多不同生物系统的设计建议。在过去的二十年里,有一百多项涉及 AAV 的临床试验开始,看来这种工具在未来几年将继续在治疗和基础研究环境中流行。

参考资料

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