【1.2】抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes)

抗生素耐药性是分子生物学中广泛使用的工具,但科学家们很少停下来思考它让我们的生活变得多么轻松。质粒转化到大肠杆菌中是一个相当低效的过程——平均只有 10,000 个细胞中有 1 个!如果没有快速确定哪些细胞成功接收到正确质粒的方法,科学家们将花费数小时到数天的时间来寻找正确的克隆。此外,质粒的存在从细菌的角度来看,这是不利的——含有质粒的细胞除了复制自己的染色体 DNA 外,还必须复制质粒,这需要额外的资源来维持质粒。将抗生素抗性基因添加到质粒中可以同时解决这两个问题——当细胞在选择性培养基上生长时,它使科学家能够轻松检测含质粒的细菌,并为这些细菌提供压力以保留您的质粒

什么是抗生素?(antibiotics)

抗生素通常被定义为杀死细菌或抑制其生长的药剂。尽管最初来自天然产品,但当今实验室中使用的许多常见抗生素都是半合成或全合成化合物。抗生素可以根据它们是直接杀死细菌(杀菌)还是减缓生长/阻止细胞分裂(抑菌)来分类;然而,这两个类别之间的区别可能有点灰色地带,因为一些抑菌剂在高浓度使用时可以杀死细菌(反之亦然)。环顾实验室,您可能会发现下表中列出的许多抗生素。请注意,在这篇文章中,我们将主要关注针对革兰氏阴性菌的抗生素 。在以后的文章中,我们将详细介绍非细菌细胞中的选择,例如酵母或哺乳动物细胞。

在实验室中还可以如何使用抗生素?

历史上,抗生素也被用于在染色体水平上破坏基因。科学家们在他们试图破坏或删除的基因的编码区内引入了一个抗生素抗性盒,这 既可以使基因失活,又可以作为突变的标记。在设计这些类型的实验时,最好不要对突变和质粒选择使用相同的抗性盒。此外,科学家可以将抗性丧失作为成功克隆的标志。在这些情况下,克隆载体通常具有两个单独的抗性盒,您的目标基因被克隆/灭活或完全去除(在Gateway 克隆的情况下)) one cassette。反选择允许科学家选择仅对保持完整的抗生素具有抗性的细菌。

提示和技巧 Tips and tricks from the bench

  • 使用新鲜的stocks。大多数抗生素在粉末形式下是稳定的,但在溶液中会迅速分解。将等分试样储存在 -20 ℃ 并避免重复冷冻/解冻循环将使大多数抗生素至少能存活 6 个月。

  • 氨苄西林分解得特别快,为了获得最佳效率,应使用平板 1 个月。小心satellite colonies!

  • 羧苄西林比氨苄西林更稳定,可在大多数应用中代替氨苄西林。

  • 抗生素对热和/或光的敏感性各不相同——。 如果使用四环素等光敏抗生素,请勿将它们添加到温度高于约 55 ℃ 的培养基中,并用箔纸包裹保存plates/stocks。

  • 请记住,某些大肠杆菌菌株具有天然的抗生素抗性,因此请确保您的质粒和大肠杆菌菌株兼容!查看这份常见大肠杆菌基因型及其天然抗性列表

参考资料

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