【1.7.1】蓝白斑筛选

克隆时能够选择含有质粒的菌落是一个很好的开始,但是能够选择含有带插入物的质粒的菌落怎么样?蓝白选择是一种广泛使用的方法来做到这一点!

注:Addgene 提供的两种流行的蓝白蛋白筛选载体是: pUC18pUC19

让我们从头开始。已充分表征的细菌lac操纵子包含一个称为lacZ的基因,该基因编码酶 β-半乳糖苷酶。lac操纵子的表达由乳糖诱导,也由乳糖类似物 IPTG(异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导。(准确地说,IPTG 结合并灭活了lac操纵子阻遏物,从而允许lac表达)。

表达时,β-半乳糖苷酶可以将一种称为 x-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的染料连接底物分解成半乳糖和一种不溶性蓝色色素(4 -氯-3-溴-靛蓝)。到目前为止,一切都很好,但这如何帮助我们筛选质粒?

实验室中的蓝白筛选

科学家发现,从lacZ基因中删除一个部分(称为 lacZΔM15 的突变)会产生一种无功能的 β-半乳糖苷酶。向 lacZΔM15 突变细菌细胞反式提供编码这部分氨基酸(称为 α-肽)的 DNA 补充了允许功能酶的突变。这个过程称为α-互补。

多克隆位点 (MCS) 存在于质粒的 lacZ 序列中。 如果将 DNA 插入质粒中的该 MCS,则 lacZ 蛋白被破坏,不会产生功能性 β-半乳糖苷酶,菌落呈白色。 如果 DNA 未插入质粒中的该 MCS,则 laxZ 蛋白不会被破坏,产生功能性 β-半乳糖苷酶且菌落呈蓝色。上述系统以下列方式投入实际使用。科学家将多克隆位点 (MCS) 设计到 α-肽(左图中的橙色楔形)中,并将其插入质粒中,从而创建了 α-互补克隆载体。当克隆反应按计划进行并且您的 DNA(红色)被克隆到此 MCS 中时,α-肽被中断,如细胞 A 所示,因此不会补充细胞的 β-半乳糖苷酶突变。不成功的克隆反应会使 α-肽保持完整,因此细胞将通过 α-互补(细胞 B)具有功能性 β-半乳糖苷酶。带有蓝色和白色菌落的细菌平板。

如右侧的代表性板块所示,带有插入质粒的菌落具有非功能性 β-半乳糖苷酶,并保持标准大肠杆菌的可爱乳白色。另一方面,完整的 β-半乳糖苷酶从 x-gal(包含在转化板培养基中)产生色素,将细菌菌落变成蓝色。我们应该注意到 IPTG 也包含在培养基中以确保lac操纵子的转录。

蓝白筛查的提示

  • 使用良好的对照:在不插入的情况下转化主链质粒。该板上的所有菌落都应为蓝色,表明您的 IPTG 和 x-gal 正常工作。

  • 不要急于完成这个过程:重要的是要给您的平板足够的时间让任何完整的 β-半乳糖苷酶表达并将 x-gal 加工成蓝色颜料(16-20 小时)。只有白色菌落的盘子非常可疑!

  • 冷藏您的平板:在初始过夜孵育后将平板置于 4C 下几个小时会增加色素沉淀,增强阴性菌落的蓝色,并允许更好地区分蓝色和白色菌落。

  • 制作板时要小心: X-gal 对光和温度敏感,需要在高压灭菌后添加到培养基中。如果铺在预制板的顶部,请确保其分布均匀,并在使用前留出足够的干燥时间。

  • 谨防误报:蓝白筛选仅表明存在 AN 插入物,不一定是您的插入物。任何破坏 α-肽 DNA 的克隆伪影也会导致白色菌落。

  • 还有假阴性:这些很少见,但如果在读框中插入一个小片段,通读会导致功能性 β-半乳糖苷酶和蓝色菌落。蓝白筛选是缩小候选对象以进行更具体分析(如 PCR 或限制性消化)的好方法。

  • 确保使用正确的大肠杆菌菌株 (即包含 lacZΔM15 突变):XL1-Blue、DH5α、DH10B、JM109、STBL4、JM110和 Top10 是一些示例。

  • 确保您使用正确的质粒 (即包含α-互补克隆MCS):pGEM-T、pUC18和pUC19以及pBluescript 是一些常见的载体。

蓝白筛选就是这样—— 一个筛选过程。它不只选择那些吸收了质粒的细胞,因此应该与选择方法结合使用。结合选择和筛选可确保您看到的白色菌落是白色的,因为克隆成功,而不是因为细胞未能吸收 α-互补质粒。通过这种方式,您可以快速轻松地识别不仅具有您的质粒(抗生素抗性),而且还确认这些质粒具有您的插入片段(蓝白筛选)的菌落。

其他类型的筛选方法

尽管蓝白筛选可能是选择含有插入片段的质粒最普遍的方法,但还有其他方法。正选择载体编码的基因在表达时对细胞是致命的。克隆片段被插入到该基因中心的 MCS 中,破坏了杀伤力。这类似于蓝白色屏幕中的 α-肽 DNA 破坏。抗生素选择也与此方法结合使用,以确保阳性菌落确实具有含有致死基因的质粒。一个例子是Gateway® Cloning 中常用的ccdB基因系统。

还有一些方法可以在不使用抗生素抗性的情况下选择含有质粒的细胞。这些依赖于对某些培养基成分敏感或依赖的细胞系,并被转化质粒上提供的基因拯救。此类质粒可能包含允许在特定培养基中使用特定底物的基因,没有这些基因,细胞就无法繁殖形成集落(用于补充营养缺陷型细胞系),或者包含拯救致死表型的基因。

参考资料

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