【7.7】对照质粒

科学家们每天都在进行许多不同类型的实验。尽管设计和结果可能会有所不同,但在每个基于实验的假设调查中都应该存在一件事:适当的控制!

对于每一个实验,研究人员都需要一个标准来比较结果;缺乏适当控制的实验结果总是不确定和不可靠的。适当的控制提供了常数变量,可以正确解释您正在测试的自变量的影响。重要的是,它们展示了您的实验系统的功能,并帮助您确定在您的实验中进行故障排除或优化的机会。继续阅读以了解有关可用于基于质粒的实验的各种对照的更多信息。

什么是对照质粒?

通常,对照质粒有助于确保在您的实验中观察到的现象与您正在测试的自变量而不是其他一些意外因素特别相关。对照质粒用于最小化非自变量的任何影响。

为了说明对照质粒的重要性,我们将采取超越抽象讨论的一步,并遵循基于质粒的实验的示例,描述其必需的对照质粒,并讨论为什么这些对照质粒对于正确设计实验至关重要.

实验:使用质粒表达的shRNA抑制基因 X 的表达

假设的转染数据,其中与未处理的细胞相比,表达针对基因 X 的 shRNA 的质粒 A 对基因 X 的表达水平没有影响。 然而,细胞没有用对照质粒处理。

上面显示的结果来自单个实验,其中将质粒 A(在骨架 Y 中编码针对人类基因 X 的 shRNA)转染到人类细胞中。

从这个结果可以简单地得出结论,shRNA 不起作用,因为用质粒 A 处理的细胞中基因 X 的表达水平与未处理细胞中基因 X 的表达水平相似——但我们能确定吗?我们知道质粒是否成功进入细胞吗?shRNA 目标是否正确?纯化的质粒 DNA 是否可行?还是细胞毒?事情是如何以及在哪里出错的?使用适当的对照质粒将解决和回答这些问题。

对照质粒的类型

计划实验的一部分包括确定需要控制哪些因素以消除对结果的任何其他解释。通常,基于质粒的实验采用转染、阴性、阳性和复制对照。

转染对照:空载体和内部对照 Transfection controls: empty vector and internal control

转染对照可测量转染效率并能够观察转染本身(即用于转染的载体、转染试剂或转染过程)可能对靶细胞产生的任何影响。一种转染对照是空载体对照;具体来说,没有自变量的质粒。回顾与图 1 相关的实验,自变量是 shRNA。因此,空对照载体将是质粒 A sans shRNA,或单独的骨架 Y。空载体对照可让您检查转染试剂或转染过程本身是否对靶细胞有任何细胞毒性作用。

另一种类型的转染控制是内部控制载体,它测量转染效率。内部对照可以是组成型表达报告蛋白(例如,GFP或萤光素酶)的质粒,该质粒与测试质粒共转染或转染到细胞的单独孔中。无论如何,报告蛋白活性的数量与转染到细胞中的 DNA 数量和细胞表达蛋白质的能力相关。

在分析图 1 中的结果时,内部对照,例如表达 GFP 的质粒 B,可以证明细胞是否成功转染并表达蛋白质。例如,我们的实验产生的荧光显微镜图像包括上述内部对照,并且与图 1 中的结果一致,可能如下所示:

图 2:质粒 B 的表达(作为内部对照)

用质粒 B(一种内部对照质粒)转染质粒的假设数据。 质粒表达 GFP 并证明细胞是否成功转染。 对于这个假设实验,细胞不表达来自质粒 B 的 GFP,因此转染不成功。

该结果表明转染不成功,因为没有来自活细胞的 GFP 荧光。该结果 为转染试剂和过程的故障排除和优化提供了机会。 重要的是要注意最佳实验条件,包括用于任何个体或共转染的质粒 DNA 量,应根据经验确定。

阴性对照:未处理细胞、空载体对照和非靶向对照

阴性对照条件和质粒应产生无效效应(即未观察到任何现象)。 在任何基于质粒的实验中,都应包括未经处理的细胞,因为它们提供了可以与其他样品进行比较的基线/标准。

空载体对照(如上所述)也可作为重要的阴性对照。 在这种情况下,空载体对照显示载体/骨架本身对靶细胞中基因表达的任何影响。

在使用基因靶向或基因组编辑技术(如 RNAi 或 CRISPR)的实验中,非靶向对照可能是合适的,因为它们允许您评估观察结果的特异性。非靶向对照是产生类似产物的阴性对照,但不靶向实验细胞中的内源基因。 例如,在上面的实验中,质粒 A 包含靶向人类基因 X 的 shRNA,并且人类细胞正在被转染。 本实验中适当的非靶向对照可以是不靶向任何哺乳动物基因的 shRNA(与质粒 A 处于同一骨架中)。这种非靶向对照对于正确解释结果至关重要,因为它在分析靶向人类 X 基因的 shRNA 的特异性时提供了一个重要的参考点。非靶向对照还评估了将 shRNA 普遍引入您的靶细胞。

阳性对照

阳性对照质粒应产生预期的现象。前面描述了阳性对照的一个例子,即内部对照载体。 一旦您确定您的条件有利于将质粒 DNA 成功递送到细胞中,内部对照载体就可以作为转染的阳性对照,因为它会产生预期的效果,即绿色荧光细胞(图 3)。

图 3:质粒 B 的表达(作为阳性对照)

用阳性对照质粒转染的假设数据。 一旦转染条件被优化,内部对照载体将作为转染的阳性对照,因为它产生了预期的结果。 对于这个假设实验,阳性对照质粒表达 GFP。

其他阳性对照是特定于实验的,应相应地设计。如果您正在尝试激活一个基因,您应该设计一个显示最大激活的控件。同样,如果你试图抑制一个基因,你的控制可能是一个完全敲除该基因表达的系统。 根据实验需要,这些控件可能基于也可能不是基于质粒的。以我们的实验为例,在质粒 A 中靶向人基因 X 的 shRNA 的预期结果是基因 X 的表达降低。因此,阳性对照应降低基因 X 的表达。

由于控制质粒的关键特征是尽量减少实验中非自变量的影响,因此阳性对照质粒的设计和选择都应该对实验和自变量的询问具有高度的特异性。

重复对照:技术和生物学

可靠的结果可以从适当控制的实验中重现。观察到的与自变量相关的表型应该随着时间的推移和来自表达自变量的纯化测试质粒的不同制剂保持一致。有两种类型的重复控制:技术和生物。

一般来说,技术复制可以被认为是“板控制” 。它们不是独立的, 通常来自一个来源。相反,生物复制是独立的, 可以被认为是“再现性控制”。生物重复构成了您的样本量(也就是您的 n 值)”,并且应该来自多个独立的来源。我们将在下面详细介绍这些,但参考部分中引用的论文提供了更深入的信息。

技术复制 Technical replicates

技术控制的一个例子是用来自同一等分试样/制剂的纯化质粒转染多个单独的孔(在同一板内)。重复对照不测量或评估自变量效应的重现性,因为每个孔中使用的纯化质粒、细胞和培养基不是独立的:它们来自同一来源并在同一块板上孵育同时。尽管重复控制很重要,但它说明了进行实验的试剂和手的一致性,而不是与自变量相关的观察到的表型的再现性或一致性。

生物重复 Biological replicates

在任何给定的一组实验中,生物控制都更耗时,最终也更重要。理想情况下,每个生物复制都应使用新鲜培养基,测试独立的细胞和质粒等分试样,在不同的日期进行等,但外部限制可能会施加一些限制,您在解释结果时应该意识到这些。生物控制的关键是独立性:至少你应该在不同的日子从头到尾重复你的整个实验多次。使用我们上面的例子,我们将在不同的日子在不同的细胞等分试样中测试不同的质粒 A 制剂。

现在让我们重新审视我们的实验。在图 1 中,似乎 shRNA 似乎没有抑制基因 X 的表达,但如图 2 所示,这可能是由于原始转染条件所致。现在我们已经成功转染了我们的细胞(图 3),我们可以继续我们的实验,加入额外的阳性和阴性对照,进行多次重复,并最终获得可解释的结果:

设计和选择合适的实验控制并非易事,因为生物系统有许多变量。无论设计和执行这些步骤可能多么令人生畏,适当的控制是负责任的科学探究和调查的基本原则。

参考资料

个人公众号,比较懒,很少更新,可以在上面提问题,如果回复不及时,可发邮件给我: tiehan@sina.cn

Sam avatar
About Sam
专注生物信息 专注转化医学