【6.1】cre-lox

我们回顾了许多重要的质粒元素 -启动子、复制起点、蛋白质标签和抗生素抗性标记 (仅举几例)。在本期中,我们将看看一个非常有趣的工具,它可用于在转基因动物、胚胎干细胞和/或组织特异性细胞类型中创建特定的、靶向的 DNA 修饰: Cre-lox 重组。

什么是Cre-lox?

Cre-lox 系统是一种可用于诱导位点特异性重组事件的技术。 该系统由源自 P1 噬菌体的两个组件组成:Cre 重组酶和 loxP 识别位点。P1 噬菌体使用这些成分作为其自然病毒生命周期的一部分,研究人员已经调整了这些成分以用于基因组操作

Cre重组酶,最初命名是因为它“ causes recombination”(虽然以后简称为“ cyclization重新combinase”),是一种38kDa的蛋白负责在loxP序列识别位点分子内和分子间的重组。 该系统的一个关键优势是 Cre 独立于任何其他辅助蛋白或辅助因子发挥作用,从而允许在各种实验中广泛应用。

LoxP位(locus of X(cross)-over in P1)位点是34碱基对由两个13-bp的长回文重复序列的长的识别序列由8个碱基长不对称核心间隔区序列分开。核心序列的不对称性给出了 loxP 位点的方向性,典型的 loxP 序列是 ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。 loxP 序列不会在除 P1 噬菌体之外的任何已知基因组中自然出现,并且足够长,几乎不可能随机出现。因此,在 DNA 序列中的特定位置插入 loxP 位点允许进行非常具体的操作,如下所述。

它是如何工作的?

如上所述,Cre 重组酶催化两个 loxP 位点之间的位点特异性重组事件,这两个 loxP 位点可以位于相同或不同的 DNA 片段上。单个 loxP 位点上的两个 13bp 重复序列都被Cre 蛋白识别并结合 ,形成二聚体。 然后两个 loxP 位点以平行方向排列,从而使四种 Cre 蛋白形成四聚体。 双链 DNA 断裂发生在每个 loxP 位点的核心间隔区,两条链连接,导致相互交叉事件。

根据 loxP 站点的位置和方向,此事件可以产生三种一般结果:

倒位(Inversion):如果 loxP 位点位于同一条 DNA 链上且方向相反,则重组会导致倒位,并且 loxP 位点之间的DNA 区域会反转。

删除(Deletion):如果位点面向同一方向,则 loxP 位点之间的序列被切除为环状 DNA 片段(并且不保留)。

易位(Translocation):如果位点位于不同的 DNA 分子上,则会在 loxP 位点产生易位事件。

我如何使用 Cre-lox?

Cre/lox 系统是一种成熟的研究工具,尤其是在小鼠转基因领域。下面列出了一些最常见的用途。

  • Cre 依赖的基因表达——在感兴趣的基因上游的任一侧(通常称为“lox-stop-lox”或“LSL”盒)放置一个带有 loxP 位点的终止密码子将在没有 Cre 的情况下阻止基因表达。在 Cre 存在下,终止密码子被切除,基因表达继续进行。一种流行的 lox-stop-lox 质粒来自 Tyler Jack 的实验室: Lox-Stop-Lox TOPO。

  • 依赖于Cre的基因敲除-相反,将loxP位点上的基因的任一侧上(称为“floxing”,对于“ flanked by loxP ”),将允许基因表达直到酶Cre存在时,在该时间该基因将是中断或删除。

  • 选择标记去除——在传统的小鼠靶向中,使用抗性标记选择目标克隆;然而,通常希望在初始选择过程后去除标记。通过浮动选择标记,Cre 可用于轻松执行此驱逐。

  • 受调控的 Cre 表达——将 Cre 置于仅在某些细胞或组织类型中、在某些发育阶段有活性的启动子下游,或通过使 Cre 可诱导(例如使用他莫昔芬或强力霉素),Cre 重组酶只能在特定的细胞或组织类型中表达单元格或在指定时间。将其与上述一些 loxP 方法相结合,可以基于实验约束来限制遗传修饰。这已被用于广泛的目的,包括仅在特定器官中激活癌基因,或绕过胚胎致死率。

为了促进 Cre-lox 技术的使用,已经构建了在各种普遍存在和受调控的启动子下表达 Cre 的转基因小鼠,并且还构建了许多含有 loxP 的等位基因。此外,已使用含 Cre 的腺病毒 (Ad-Cre) 或 AAV ( AAV-pgk-Cre ) 成功将 Cre 引入感兴趣的细胞。

如果我需要两个单独的重组事件怎么办?

使用 loxP 位点的一个潜在限制是,如果存在两个以上的 loxP 位点,则无法严格控制哪些 loxP 位点重组;分子内事件的发生频率高于分子间事件,但任何两个位点都可能发生重组。为了解决这个问题,已经创建了 loxP 位点的替代突变版本,其中包含一个独特的不对称间隔“ NNNTANNN”,其中“N”表示哪些碱基可能与规范序列不同。 其中包括 loxN (GtATACcT)、lox2272 (GgATACtT )和 lox511 (GtATACAT)。这些变异的 lox 位点与其他相同类型的位点进行重组,但不交叉兼容。使用不同的 lox 位点变体允许 Cre 在单个系统中催化多个特定的重组事件。

酿酒酵母 FLP-FRT 重组系统是另一种在概念上与 Cre-lox 非常相似的定点重组技术,翻转酶 (Flp) 和短翻转酶识别目标 (FRT) 位点分别类似于 Cre 和 loxP。FLP-FRT 技术可以成为 Cre-lox 的有效替代品,并且还与它结合使用,允许并行控制两个单独的重组事件。

参考资料

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