【6.5】CRISPR技术

尽管 1987 年最初在大肠杆菌中发现了成簇的规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)或 CRISPR 序列,但这些序列作为对抗噬菌体的保护措施的概念直到 20 年后才出现。最初的实验将嗜热链球菌暴露于捕食性噬菌体,以测试外源 DNA 是否会被整合到细菌基因组中。这些研究的结果使科学家们假设原核生物开发了一种适应性免疫系统,该系统利用各种 CRISPR 相关基因或 Cas 基因,不仅可以存储入侵噬菌体的记录,而且还可以在再次暴露时破坏噬菌体。更具体地说,Cas 蛋白将外源 DNA 剪成约 30 bp 长的小片段,并将其插入 CRISPR 序列中。来自这些 CRISPR 基因座的 RN​​A 被转录并用于将 Cas 核酸酶引导至与目标互补的特定外源 DNA。一旦 CRISPR/Cas 复合物与这种外来 DNA 结合,就会进行切割以摧毁入侵者。

CRISPR/Cas 启发的基因组编辑最初由 Cong 等人描述。 和马里等人。 2013 年 1 月,是目前基因组工程最常用的技术。 该系统有两个不同的组成部分:(1) 引导 RNA 和 (2) 核酸内切酶,在这种情况下是 Cas9(见下图)。 向导 RNA 将独特的 20 个核苷酸靶序列和 Cas9 招募的 tracrRNA 序列组合成单个嵌合向导 RNA (gRNA) 转录本。

当在细胞中表达时,gRNA/Cas9 复合物通过 gRNA 目标序列与其在基因组 DNA 中的互补序列之间的碱基配对被募集到目标序列。 为了使 Cas9 成功与 DNA 结合,基因组 DNA 中的目标序列不仅必须与 gRNA 序列互补,而且还必须紧随其后是正确的原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列。 请注意,PAM 序列存在于 DNA 目标序列中,但不存在于 gRNA 序列中,任何具有正确目标序列后跟 PAM 序列的 DNA 序列都将被 Cas9 结合。 Cas9 与 DNA 结合的功能后果取决于表达的 Cas9。

已经开发了以下 Cas9 用途:

  • 剪切(cut):野生型 Cas9 有效地在与共表达的 gRNA 同源的序列处产生双链断裂。 这些双链断裂通常通过非同源末端连接 (NHEJ) 修复,这会导致基因中断。 如果提供了包含与剪切区域同源性的修复模板,则可以通过同源定向修复 (HDR) 修复剪切,导致特定的靶向突变或基因插入(基因编辑)(见上图)。

  • Nick:Cas9 酶的突变“切口酶”版本产生单链 DNA 断裂 (Nick),而不是双链 DNA 断裂 (Cut)。 当靶向基因组中两个独特的近端位点时,由于需要两个孤立的近端切割事件,切口酶可以产生比 wt Cas9 具有更高特异性的双链断裂。

  • 干扰(Interfere:):催化失活的 Cas9 (dCas9) 可以通过干扰转录来抑制基因表达。 dCas9 有时可以与额外的阻遏肽融合,从而可能增强基因敲低。

  • 激活(Activate):当靶向启动子或其他调节区时,与激活肽融合的无催化活性的 Cas9 (dCas9) 可以激活或增加基因表达。

  • dCas9-FokI:催化失活的 Cas9 (dCas9) 与 FokI 核酸酶融合,在与两个共表达的 gRNA 同源的序列处产生双链断裂 (Cut)。

  • 纯化(Purify):使用与表位标签融合的无催化活性的 Cas9 (dCas9) 分离感兴趣的特定基因组区域。

  • 可视化:使用与荧光蛋白融合的无催化活性的 Cas9 (dCas9) 可视化感兴趣的特定基因组区域。

上面列出的 Cas9 变体都是基于化脓链球菌版本的核酸酶; 然而,目前正在研究来自不同物种(如脑膜炎奈瑟球菌、金黄色葡萄球菌和其他物种)的 Cas9 核酸酶的基因组编辑能力。 2015 年底,张峰实验室的研究人员还发现了一种新的 Cas9 同源物 Cpf1,它除了只需要 1 个 RNA 分子进行基因靶向外,还能在具有 TTN PAM 序列的靶位点产生交错切割。 这些交错切割可能使 Cpf1 比 Cas9 及其变体更适合 HDR 介导的基因编辑。

参考资料

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