【1.8.2】用于蛋白质表达的大肠杆菌菌株

虽然大肠杆菌菌株非常适合克隆目的,但这些大肠杆菌菌株通常不太适合重组蛋白表达。在大肠杆菌中过度表达外源蛋白时会出现许多挑战。我们将回顾重组蛋白表达的潜在陷阱以及一些旨在避免它们的最流行的商业菌株。

为什么我需要表达菌株?

来自高拷贝数质粒和强大启动子的蛋白质表达将大大超过任何天然宿主蛋白质的表达,消耗细胞中的宝贵资源,从而导致生长减慢。此外,某些蛋白质产物在表达时可能对宿主有毒,尤其是那些不溶性、作用于 DNA 或具有酶活性的蛋白质产物。出于这个原因,重组蛋白通常在大肠杆菌中表达,使用诱导型启动系统(稍后将讨论)设计为适应高蛋白负载。 除了下面概述的基本基因型外,某些特殊菌株可用于提供更好的转录控制,协助正确的蛋白质折叠,并处理次优密码子使用(表 1)

一些突变是所有或大多数表达菌株共有的,以适应高蛋白质水平,包括:

  • ompT:携带此突变的菌株缺乏外膜蛋白酶 VII,这会降低表达的重组蛋白的蛋白水解。
  • lon 蛋白酶:完全删除的菌株(指定为 lon 或 Δlon)类似地降低了表达蛋白质的蛋白水解。
  • hsdS B (r B - m B - ):这些菌株具有失活的天然限制/甲基化系统。这意味着该菌株既不能限制 DNA,也不能甲基化 DNA。
  • dcm:同样,具有这种突变的菌株无法在特定序列内甲基化胞嘧啶。

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表 1:大肠杆菌表达菌株

诱导表达是如何工作的?

如上所述,许多表达质粒利用诱导型启动子,在将诱导剂(如 IPTG)添加到生长培养基之前,这些启动子是“无活性的”。诱导时间很重要,因为您通常希望确保您的细胞首先达到合适的密度。处于指数生长期的细胞是活的和健康的,这使它们成为蛋白质表达的理想选择。如果您等待太长时间进行诱导,您的培养物将开始收集死细胞,相反,您不能过早进行诱导,因为培养物中没有足够的细胞来制造蛋白质。

DE3 溶原(lysogen)/T7 启动子组合是最流行的诱导系统。DE3 溶原菌在 lac 阻遏物的控制下表达来自细菌基因组的 T7 RNA 聚合酶 (RNAP),可通过添加 IPTG 诱导。然后可以使用 T7 RNAP 从质粒上的 T7 启动子转录感兴趣的基因。许多商业菌株携带 DE3 溶原菌,如菌株名称所示。相反,其他菌株如 M15(pREP4) 使用 lac 抑制子直接作用于表达质粒,以抑制来自杂交启动子的转录。

尽管 DE3/T7 RNAP 系统适用于大多数实验,但 lac 启动子可能会“泄漏”(leak),这意味着即使不添加 IPTG 也存在低水平的表达。这主要是有毒蛋白质产品的问题,它会阻止培养物在合理的时间范围内达到所需的密度。对于这些情况,一些菌株带有额外的控制措施,例如抑制基础 T7 表达的 pLys 质粒。pLys 质粒包含用于阳性选择的氯霉素抗性盒和 p15A 复制起点,使其与其他 p15A 质粒不相容。pLys 有两种形式——pLysS 和 pLysE——区别在于后者提供了对基础表达的更严格控制。

如果我没有看到蛋白质过度表达怎么办?

对于大多数目的,上述菌株应该产生足够的表达水平,但是当您尝试了一种常见菌株并且没有获得所需水平(或任何)蛋白质表达时,您会怎么做?低表达结果可能有多种来源,所以不要担心——有一些简单的故障排除措施可以帮助您重回正轨:

  • 兼容性:仔细检查您的质粒骨架和表达菌株以确保它们兼容。例如,阿拉伯糖诱导型质粒不会在 IPTG 诱导菌株中表达,p15 质粒也不会与 pLys 菌株相容。您的菌株可能需要额外的抗生素选择或特殊的生长培养基,或者如果您的质粒是低拷贝的,请考虑降低抗生素浓度。

  • 生长温度:通过设置小规模表达实验来测试温度、时间和培养基条件等变量来分析您的表达条件。许多重组蛋白在 30°C 或室温下表达更好,这是通过在 37°C 下将您的培养物培养至所需密度并在添加诱导剂前降低温度或将其移至台式摇床 10-20 分钟来实现的.

  • 生长培养基:更换培养基很棘手,因为可能需要在生长速度和蛋白质质量之间进行权衡。对于许多蛋白质,富培养基(如 TB 或 2XYT)是最佳选择,因为它们支持高细胞密度;然而,如果蛋白质产物被分泌到培养基中或者如果由于溶解性问题需要缓慢表达,则补充有 M9 盐的基本培养基可能是优选的。

  • 不溶性和分泌性蛋白质:最常见的纯化方案是为可溶性、囊溶性蛋白质产品设计的,但这并不总是可以实现的。含有疏水区域或多个二硫键的蛋白质可能会聚集并变得不可溶。这些不溶性的错误折叠蛋白团被称为包涵体,可以使用特殊方案进行回收和纯化。或者,降低诱导剂的浓度或添加亲和标签(如 GST)可能有助于解决溶解度问题。

参考资料

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