【5.1.2】Flag-tag

1. 什么是Flag标签?

Flag-tag 是一种常用的表位或肽标签,并非源自天然蛋白质。Flag-tag 是一种人工标签,基于肽序列,也称为 DYKDDDDK-tag。Flag-tag 用于标记蛋白质以用于多种捕获和检测应用。

2. Flag-tag 是如何工作的?

使用与标记结合的抗标记抗体研究标记标记的蛋白质。 Flag-tag 是在 N 端或 C 端克隆到感兴趣的蛋白质上。表达后,重组Flag-tag融合蛋白可以通过ELISA、流式细胞术、免疫荧光(IF)、免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白质纯化和蛋白质印迹(WB)进行分析。

三、Flag-tag的结构

Flag-tag 八肽的结构

4、Flag-tag的开发与发现

Flag标签首先由 Hopp et al. (1988)*.

5. 属性

Flag-tag 包含 8 个氨基酸 (aa) 并具有序列基序 NH2-DYKDDDDK-COOH (Asp-Tyr-Lys-Asp-. Asp-Asp-Asp-Lys)。该序列包含一个肠激酶切割位点 (DDDDK)。肠激酶的切割从标记标记的蛋白质中去除Flag-tag 。除了 1x Flag-tag 之外,3x Flag-tag 也是常用的。最常用的序列基序不是 1x Flag 序列的简单重复:DYKDHDG-DYKDHDI-DYKDDDDK。

6. 如何标记蛋白质?

与其他蛋白质和肽标签一样,Flag-tag 附着在感兴趣的蛋白质 (POI,protein of interest) 上。通常,Flag-tag 被克隆到 DNA 质粒中的 POI 的框架内。然后将重组 DNA 质粒用于转染。

7. Flag-tag 和 3x Flag-tag 的大小

Flag-tag

  • 氨基酸数:8
  • 分子量 (MW):1012.98 Da

3x Flag-tag

  • 氨基酸数:22
  • 分子量 (MW):2730.71 Da

8. Flag-tag 和 3x Flag-tag 的规格

Flag-tag:

  • 理论等电点(pI):3.97,反映氨基酸残基带负电程度高。Flag-tag 共有七种带电氨基酸,带电。
  • 带负电荷的残基总数(Asp + Glu):5
  • 带正电荷的残基总数(Arg + Lys):2
  • 带电荷的残基总数:7。

3x Flag-tag:

  • 理论 pI:4.16
  • 带负电残基总数(Asp + Glu):11
  • 带正电残基总数(Arg + Lys):2
  • 带电残基总数:13。

9. * 标签表位标签序列

Flag-tag

Flag-tag 氨基酸序列: DYKDDDDK

标记标签 DNA 序列: GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG

3x Flag-tag

3x Flag-tag氨基酸序列: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK

3x 标记氨基酸序列:

GAC TAC AAG GAC CAC GAC GGT GAC TAC AAG GAC CAC GAC ATC GAC TAC AAG GAC GAC GAC GAC AAG TGA

D=天冬氨酸;G=甘氨酸;H=组氨酸;I = 异亮氨酸;K=赖氨酸;Y=酪氨酸

10. 什么时候应该使用 3x Flag,什么时候应该使用 1x-Flag-tag?

这个问题没有简单的答案。3x Flag-tag 长度的增加增加了 anti-Flag 抗体/亲和试剂的亲和力。3x Flag-tag 常用于串联纯化和蛋白质纯化。如上所述,3x-Flag-tag 比 1x-Flag-tag 更长,并且具有更多带电氨基酸。带负电荷和带正电荷的氨基酸可能更强烈地干扰 POI,并可能影响蛋白质表达。

对于Western blot的检测,1x Flag-tag 就足够了。

11、为什么Flag-tag也叫DYKDDDDK-tag?

FLAG 是 Sigma-Aldrich Co. LLC 的注册商标。其他供应商可能会将 Flag-tag 称为 DYKDDDDK-tag。

12. 应用程序

虽然 Flag-tag 已被开发为用于 IP 和蛋白质纯化以及免疫印迹的捕获标签,但它也用于免疫荧光。

13. Flag- vs. Myc-tag

Flag-tag 和 Myc-tag 的比较

 	Flag标签   	Myc标签
起源  	-	人类c-Myc
3D结构	
氨基酸序列	DYKDDDDK	EQKLISEEDL
氨基酸数  	8	10
分子量(Da)	1012.98	1203.31
理论等电点 (pI)	3.97	4.00
带负电荷的残基总数 (Asp + Glu)	5	4
带正电荷的残基总数 (Arg + Lys)	2	1

14. Flag-tag 和 HA-tag 的比较

 	  Flag标签	HA标签
起源	  -	     人流感血凝素(HA)来源于人流感病毒
3D结构	
氨基酸序列	DYKDDDDK	YPYDVPDYA
氨基酸数	8	9
分子量(Da)	1012.98	1102.17
理论等电点 (pI)	3.97	3.56
带负电荷的残基总数 (Asp + Glu)	5	2
带正电荷的残基总数 (Arg + Lys)	2	0

15. Flag-tag 和 Spot-Tag 的比较

 	   Flag标签	现货标签
起源	     -	源自人类β-连环蛋白
3D结构	
氨基酸序列	DYKDDDDK	PDRVRAVSHWSS
氨基酸数	8	12
分子量(Da)	1012.98	1396.53
理论等电点 (pI)	3.97	10.03
带负电荷的残基总数 (Asp + Glu)	5	1
带正电荷的残基总数 (Arg + Lys)	2	2

16. Flag-tag 和 V5-tag 的比较

 	   Flag标签	V5-标签
起源	     -	猿病毒5的P和V蛋白
3D结构	
氨基酸序列	DYKDDDDK	GKPIPNPLLGLDST
氨基酸数	8	14
分子量(Da)	1012.98	1421.66
理论等电点 (pI)	3.97	5.84
带负电荷的残基总数 (Asp + Glu)	5	1
带正电荷的残基总数 (Arg + Lys)	2	1

17. 如何洗脱Flag-tagged蛋白?

Flag-tag 融合蛋白可以通过以下方法洗脱

  1. 使用 Flag 肽进行竞争性洗脱:1x Flag 肽或 3x Flag 肽。
  2. 请注意,1x Flag 肽段不会洗脱 3x Flag 标记的蛋白质
  3. 用甘氨酸 (pH2.5) 进行酸性洗脱
  4. SDS 样品缓冲液

18. Flag-tag plasmids

用于表达包含哺乳动物细胞、果蝇等的多克隆位点 (MCS) 的标记标签的载体可从包括默克 (Sigma Aldrich) 和 Novus Biologicals 在内的许多供应商处获得。Addgene 也是一个来源。

19. 有哪些抗Flag-tag抗体,有哪些抗DYKDDDDK抗体?

重组、单克隆和多克隆抗Flag抗体可从多家供应商处获得。ChromoTek提供即用型DYKDDDDK Fab-Trap™,用于对标记标记的蛋白质进行高效和高纯度的免疫沉淀。

Proteintech提供已针对不同应用(包括免疫荧光 (IF)、免疫沉淀 (IP)、ELISA 和蛋白质印迹 (WB))进行验证的自制抗Flag 抗体:

参考资料

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