【6.6】FLEx 载体

在前一篇文章中,我们了解了Cre-loxP 重组系统如何用于诱导位点特异性重组事件,以及侧翼 loxP 位点的方向指导 Cre 重组酶反转、易位或切除一个 DNA 片段。野生型和突变型 loxP 位点的可用性使科学家能够以新的、创造性的方式利用该系统。今天的帖子将重点介绍一种这样的策略——FLEx 开关——它利用重组元件关闭一个基因的表达,同时打开另一个基因的表达!

什么是 Flex 开关?

FLEx(或“ flip-excision”)开关被设计为一种遗传工具,供研究人员有条件地操纵体内基因表达使用位点特异性重组。FLEx 开关利用了位点特异性重组酶 (SSR) Cre 和 FLP 的方向特异性。SSR 在目标位点结合 DNA 以诱导位点特异性重组事件:Cre 重组酶结合 loxP 位点,而 FLP 结合 FRT 位点。当 DNA 序列的两侧是相反方向的目标位点 (floxed) 时,SSR 将反转位点之间的 DNA 序列。如果 DNA 序列以相同方向流动,SSR 将切除 DNA 片段。通过操纵使您感兴趣的基因流动的目标位点的数量、方向和类型,可以为您的特定实验需求创建强大的 FLEx 开关。

FLEx 开关如何工作?

假设您想设计一个基因 FLEx 开关,关闭 BFP 表达,同时打开 mCherry 表达。为了使该 FLEx 开关成功工作,cassette需要包含有义方向的 BFP 编码序列,然后是反义方向的 mCherry 编码序列(图 1,顶部)。整个 DNA 盒的两侧将是两对目标位点——一对野生型(loxP,黑色箭头)和一对突变型(例如,lox511,白色箭头)。必须使用两对不同的目标站点(target sites)才能使此策略有效地工作。loxP 和 lox511 都被 Cre 识别,但 lox511 位点只能与其他 lox511 位点重组,不能与 loxP 位点重组。或者,您可以使用一对 loxP 位点和一对 FRT 位点,并包括 Cre 和 FLP 重组酶。

一旦引入了选择的 SSR,重组就可以通过首先利用 loxP 位点或 lox551 位点来进行。无论如何,第一个重组步骤将使用 loxP 或 lox511 位点反转插入的 DNA 片段,在 DNA 片段的一端留下两个相同的位点(图 1,中间)。然后第二个重组事件切除相同 loxP 或 lox511 位点之间的 DNA(图 1,底部)。由于只有一个 loxP 和 lox511 位点保留在 DNA 片段的任一侧,因此即使存在 Cre 重组酶,任何额外的重组事件也不可能发生。该质粒现在专门驱动 mCherry 而不是 BFP 的表达。

除了切换荧光团,为什么 FLEx 有用?

FLEx 系统的强大之处在于能够有条件地关闭一个基因并激活另一个基因。在小鼠遗传学领域,FLEx 目前被用于研究各种体内条件基因拯救实验,以及光遗传腺相关病毒 (AAV) 载体的改进。下面列出了 FLEx 开关的一些其他用途:

  • 基因敲除的条件拯救(Conditional rescue of a gene knockout): 要测试您观察到的表型是否真的是由于敲除小鼠中删除的单个基因造成的,您可以设计一个 FLEx switch 条件敲入盒。使用 Cre 激活基因表达的 FLEx 开关如图 2 所示,该盒应包含有义方向的报告 DNA 序列(例如 GFP),然后是您想要在反义方向拯救的基因的编码序列(我们称基因为“GeneR”) . 这个实验的关键是两对目标位点的放置。通过将一个 loxP 位点和一个 lox511 位点置于相同方向的报告基因两侧,并将额外的 loxP 和 lox511 位点置于相反方向的反向 GeneR 序列之后,您创建了一个仅在 Cre 存在的情况下表达 GeneR 的盒式磁带. 在本例中,Cre 将首先 反转报告基因和 GeneR 片段。然后第二次重组事件将被 切除来自盒式磁带的报告基因,允许 GeneR 表达。这允许研究人员测试单独表达 GeneR 是否可以挽救正在研究的表型。

  • 我导论有条件的点突变或功能性突变体内(Introduction of a conditional point mutation or functional mutation in vivo): 一种有条件救援实验与基因的野生型副本类似,您还可以设计柔性切换到有条件地测试各种点突变和截短的功能,在没有内源性的基因

  • 光遗传学报告基因的时空表达(Spatio-temporal expression of optogenetic reporters): 由于大多数光遗传学报告基因是使用 AAV 注射传递的,注射部位周围的大多数细胞将被感染,并有可能表达转导的报告基因。生成 FLEx 开关来控制光遗传报告基因的表达将确保报告基因保持沉默,直到提供细胞或组织特异性 Cre。由于 FLEx 开关确保了依赖于 Cre 的报告基因表达,报告基因背景表达的可能性将大大降低,从而可以更清晰地表征目标神经元群的位置、形态和电路图。

有时也被称为DIO( Double-floxed inverse Orientation ),FLEX系统通常被认为是“Cre-On”这意味着你在反/反义“关”的位置的兴趣开始的基因,并 sense( on) 在存在 Cre 的情况下定向。类似的策略可用于“Cre-off”(即您感兴趣的基因从有义方向开始,而 Cre 用于将其翻转为“关闭”)。这些酶Cre断开关可以被称为DO( Double-floxed Orientation )和可用于研究某些细胞群的生理或行为。

参考资料

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