【4.3】我应该使用哪种荧光蛋白

荧光蛋白 (FP) 于 50 多年前首次被发现,当时发现了绿色荧光蛋白 (GFP),这是一种来自维多利亚水母的蛋白质。自那次发现以来,FP 家族不断扩大,有数百种可用变体。继续阅读以熟悉可用的 FP 发射颜色和在为即将进行的实验选择 FP(或两个)时要记住的 10 点。

荧光是吸收光的物质发出的光。发射光的波长比激发波长长。因此,FP 是具有这种独特能力的蛋白质。

当在大多数生物体中异位表达时,这些 FP 中的许多是荧光的。此外,将 FP 与另一种蛋白质融合通常不会影响其荧光。因此,FP 被用于研究许多生物学问题。两种最常见的用途是: 1) 测试特定系统中的表达水平(通过测量荧光强度);和 2) 可视化 FP(与感兴趣的蛋白质融合)的定位,从而跟踪该生物分子在活细胞内的定位。

按发光颜色分类的 FP(发光波长范围)

FP 通常按发射颜色分类,如下所述(或发射波长范围)。通过突变 GFP,衍生出蓝色 FP (BFP)、 青色 FP (CFP) 和 黄色 FP (YFP)的变体 。要了解 GFP、它的变体及其相关突变,请查看Marcy 上周在 GFP 上的帖子。此外,在其他生物体中也发现了许多其他 FP。

除了发射波长范围外,在选择 FP 时还需要考虑其他特性:

独特的荧光蛋白类别

光活化/光转换 (Photoactivatable / Photoconvertible):当被特定的激发波长激活时,这些蛋白质可以改变它们的颜色。这意味着发射波长可以改变。在少数情况下,蛋白质的初始状态是无荧光的,因此允许非常低的荧光背景水平。这种光活化或光转化蛋白质的例子是 PA-GFP、Dendra2 和 mEOS 蛋白质。一些蛋白质是可逆转换的(例如 rsEGFP、Dreiklang)。

荧光计时器 (FT,Fluorescent Timers:这些蛋白质会随着时间的推移而改变颜色。因此,这些可以用作激活后细胞过程的“计时器”。四种主要的 FT 称为慢速 FT、中型 FT、快速 FT 和 mK-GO。

大斯托克斯位移 (LSS,Large Stokes Shift ):斯托克斯位移(以George G. Stokes命名)是波长从激发到发射的位移。对于大多数 FP,斯托克斯位移小于 50nm(通常要小得多)。对于 LSS 蛋白质,斯托克斯位移≥ 100nm。具体来说,这些蛋白质被紫外光或蓝光激发,它们的发射是绿光或红光。例如,T-Sapphire、LSSmOrange 和 LSSmKate。

荧光传感器(Fluorescent Sensors:):这些 FP 会根据环境变化(例如 pH、Ca 2+通量等)改变其激发/发射行为。最常用的是 GECI - 基因编码的钙指示剂(例如 GCaMP)。其他包括:pHluorin & pHTomato(pH 传感器)、HyPer(H 2 O 2传感器)、ArcLight(电压传感器)和 iGluSnFr(谷氨酸传感器)。更多关于这些生物传感器的例子可以在 Addgene 找到。

分裂 FPs(Split FPs )—— 一些 FPs(例如 GFP、Venus)可以分成两半,它们本身不发荧光。如果两半靠得很近,它们将形成完整的 FP 并发出荧光。分裂 FP 可用于确定融合到分裂 FP 两半的两种蛋白质的接近程度。这种技术也称为双分子荧光互补 (BiFC)。

选择荧光蛋白时要牢记的8点

  1. 激励和发射(ex/em):

    • 每个 FP 都有其独特的 ex/em 峰。因此,选择您的系统可以激发的 FP,并检测发射。例如,如果您的显微镜只有两个激光器,分别为 488nm 和 561nm,您将无法使用远红光 FP。如果您没有将蓝光传递到检测器/相机的过滤器,那么 BFP 对您毫无用处。

    • 当使用多个 FP 时,确保它们的发射光在波长上不重叠。在许多显微镜中,滤光片不够窄,无法区分密切相关的颜色。此外,大多数 FP 具有广泛的发射范围,可被更长波长的滤光片检测到(例如 GFP 也发射黄光)。

    • 请注意,某些 FP 组合会导致称为FRET(荧光 [或 Förster] 共振能量转移)的效应。当来自一个 FP(例如 CFP)的能量转移激发另一个 FP(例如 YFP)的荧光时,就会发生 FRET。FRET 仅在两个 FP 之间的距离 <10nm 时发生,并且在标记相互作用的蛋白质时应予以考虑。事实上,FRET 通常用于确定两种蛋白质是否相互作用。

  2. 寡聚化:第一代 FP 易于寡聚化。这可能会影响 FP 融合蛋白的生物学功能。因此,建议使用单体 FP(通常用“m”表示作为蛋白质名称的第一个字母,例如 mCherry)。

  3. 氧气:许多 FP(特别是那些源自 GFP 的)发色团的成熟需要氧气。因此,这些 FP 不能用于缺氧环境。最近,从鳗鱼中分离出的一种新的 GFP 被证明可以独立于氧气而成熟,因此适合在厌氧条件下使用。

  4. 成熟时间:成熟时间是指 FP 正确折叠并生成发色团所需的时间。这可以从转换后的几分钟到几个小时。例如,超级文件夹 GFP (sfGFP) 和 mNeonGFP 在 37°C 下可以在 <10 分钟内折叠,mCherry 需要约 15 分钟,TagRFP 需要约 100 分钟,而 DsRed 需要约 10 小时。

  5. 温度: FPs 的成熟时间和荧光强度会受到温度的影响。例如,增强型 GFP (EGFP) 针对 37°C 进行了优化,因此最适合哺乳动物或细菌研究,而 GFP S65T更适合酵母研究 (24-30°C)。

  6. 亮度: 亮度是衡量发射光亮度的指标。亮度计算为蛋白质的消光系数和量子产率的乘积除以 1000。在许多情况下,亮度与设置为 1 的 EGFP 的亮度进行比较。一些蛋白质非常暗(例如 TagRFP657,具有亮度0.1),应该考虑到这一点。 光稳定性会受到实验参数(例如激发光强度、pH 值或温度)的影响。

  7. 光稳定性:荧光分子在长时间暴露于激发光后会变白(即失去发光能力)。光稳定性可短至 100 毫秒 (EBFP) 或长至 1 小时 (mAmetrine1.2)。但是,对于大多数 FP,它是几秒到几分钟。光稳定性会受到实验参数(例如激发光强度、pH 值或温度)的影响。

  8. pH 稳定性:如果您计划在酸性环境中表达 FP(例如酵母细胞质,微酸性,或突触小泡),则此参数很重要。一些 FP 具有不同的 ex/em 光谱(例如 mKeima)或在 pH 变化时改变荧光强度(例如 pHluorin、pHTomato)。

参考资料

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