【4.2】绿色荧光蛋白 (GFP,Green Fluorescent Protein )

来自绿色荧光蛋白 (GFP) 等蛋白质的生物发光和荧光可能已经存在于水母等生物中数百万年了。然而,科学家们直到 1960 年代才开始研究 GFP 并推断其生化特性。现在 GFP 及其荧光衍生物是实验室的主要材料。GFP 用于众多生物学科的研究,科学家们将 GFP 用于多种功能,包括:标记基因以阐明其表达或定位特征、充当生物传感器或细胞标记、研究蛋白质-蛋白质相互作用、可视化启动子活动等等。

为什么是绿色荧光蛋白?

GFP 是一种约 27 kDa 的蛋白质,由来自水晶水母Aequorea victoria的 238 个氨基酸组成。它在可见光谱的绿色部分(因此得名)具有荧光发射波长,这是由于蛋白质中心的三个特定氨基酸(Ser65、Tyr66 和 Gly67)的成熟反应形成的发色团. 首次发现时,GFP 最令人惊讶的方面之一是发色团自发形成,无需额外的辅助因子、底物或酶活性 —— 它只需要在成熟过程中存在氧气。这意味着该蛋白质可以直接从A. Victoria 中提取并在任何生物体中表达,同时仍保持荧光。

该蛋白质结构于 1996 年首次报道,是一种含有 11 个 β-折叠的“桶”形,发色团隐藏在结构的中心,防止被水性溶剂淬灭。这种紧密堆积的结构解释了整个 GFP 蛋白的重要性,它几乎完全是维持荧光活性所必需的;可以容忍很少的截断,但是,点突变是可以接受的。与当时的传统荧光染料相比,GFP 的主要优势在于它无毒并且可以在活细胞中表达,从而能够研究动态的生理过程。

重新设计 GFP 以增加其颜色和应用范围

几乎在其序列被阐明后,科学家们就开始通过诱变设计新版本的 GFP,以改善其物理和生化特性。1995 年,Roger Y. Tsien 描述了一种 S65T 点突变,它增加了GFP的荧光强度和光稳定性。这也将其主要激发峰从 395 nm 移至 488 nm,有效改善了野生型蛋白质中发现的缺陷并促进其在研究中的广泛应用。此后许多其他突变被引入到 GFP 中,并且不断设计新的荧光团迭代。下面的表 1列出了一些常见的荧光蛋白及其相对于野生型 GFP 的突变。 虽然这里没有列出,但每种颜色中也存在许多渗透,它们之间只有细微的差异。

请注意 ,在光谱的红色一侧发现的许多荧光蛋白不是 GFP 衍生物,而是与从Discosoma sp. 中分离的dsRed蛋白相关。已经做了类似的工作来扩展红色荧光蛋白库;然而,这些蛋白质与 GFP 不同,表 2 中的突变定义可能不适用。

多种应用

由于其大小和易用性,GFP 和其他荧光蛋白已成为分子生物学的中流砥柱。科学家可以很容易地利用含有 GFP 的质粒作为实现许多功能目的的手段。我们在下面列出了我们的最爱,但目前还有许多其他用途,并且新的 GFP 技术正在不断开发中!

融合标记:最常见的用途之一,GFP 可以融合到蛋白质的 N 端或 C 端,这使科学家可以看到基因表达的时间和地点。单击此处查看 Addgene 用于构建荧光融合的空骨架集合。

转录报告基因:将 GFP 置于目标启动子的控制下可用于有效监测特定细胞类型中该启动子的基因表达。这种类型的转录报告是 GFP 最早的用途之一。

Förster 共振能量转移 (FRET):这用于研究两种蛋白质之间或发生构象变化的蛋白质的两个结构域之间的相互作用。通常使用两种具有重叠激发/发射光谱的荧光蛋白;一个与每个被测试的蛋白质或结构域融合。在此处查找 FRET 质粒。

分裂 EGFP: FRET 的替代品,分裂 EGFP 也被用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。在这种情况下,EGFP 的两部分与感兴趣的蛋白质融合,当它们靠近时,EGFP 的两半会发生折叠、成熟和荧光。

生物传感器:设计了多种基于 GFP 的荧光生物传感器来检测各种细胞内条件,包括离子(如 Ca 2+)浓度和 pH 值,使用一系列策略,如 FRET、钙调蛋白等。在此处查看 Addgene 的荧光生物传感器系列。

光遗传学:科学家可以使用光来检测、测量和控制分子信号、细胞和细胞群,以了解它们的活动并可视化改变这种活动的影响。 在 OpenOptogenetics 了解更多关于光遗传学的信息, 并 在 Addgene找到光遗传执行器和传感器。

细胞标记/选择:像质粒这样的表达构建体通常包含 GFP 作为标记,以帮助识别哪些细胞已成功吸收质粒。这可以作为抗生素选择的替代方法。这种类型的质粒可能具有在来自感兴趣基因的额外启动子控制下的 GFP,或者从与感兴趣基因相同的转录物表达,但在内部核糖体进入位点 (IRES) 之后。这通常与 FACS 结合使用(见下文)。

荧光激活细胞分选 (FACS):这是一种流式细胞术,可根据荧光信号将细胞混合物分成不同的群体。因此,FACS 可用于将表达 GFP 的细胞与不表达 GFP 的细胞分开。

发育/转基因用途:由于其稳定性,GFP 可用于细胞命运研究中的谱系追踪能力。当置于感兴趣的启动子的控制之下时,它还可以用于可视化这些启动子活跃的发育阶段。此外,GFP 可以标记转基因修饰的 ES 细胞,然后可用于植入和生成转基因小鼠。

纯化: GFP 可用作蛋白质纯化的通用表位标签,并​​且有许多针对 GFP 的商业抗体可用。

其他:我们真的只是触及了 GFP 潜在应用的表面。它还被用于识别药物筛选中的特定细胞群,在癌症研究中可视化裸鼠中的微转移,作为 DNA 双链断裂修复的报告基因,以及标记致病性细胞内微生物以可视化宿主/病原体相互作用。

参考资料

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