【2.7】Gibson组装

在过去的十年中,科学家们开发并微调了许多不同的克隆 DNA 片段的方法,这些方法为限制性内切酶克隆提供了有吸引力的替代方法。这些较新的技术变得越来越普遍,这是有充分理由的。与我们曾经完全依赖的传统限制性内切酶克隆相比,它们具有许多优势。在这篇博文中,我将介绍科学家如何使用 Gibson 组装来组装 DNA 片段的一些优点、缺点和示例。

Gibson 装配概述

Gibson 组装技术于 2009 年由 J. Craig Venter 研究所的 Daniel Gibson 博士及其同事首次描述。在 Addgene,我们在 2014 年将这个选项添加到我们在保藏过程中的常见克隆选项下拉菜单中,因为它获得了收益在人气中。众所周知,Gibson 组装可以轻松组装多个线性 DNA 片段,但也可用于将插入片段基本克隆到您选择的载体中,如下图所示。首先,您需要具有末端具有同源性区域的 DNA 片段,这通常是通过 PCR 产生的。然后,将片段与含有三种不同酶的酶预混液一起孵育:

  • 一种外切核酸酶,它咀嚼片段的 5’ 末端,产生长突出端,使具有同源性的单链区域退火
  • 聚合酶,填补空白
  • DNA 连接酶,用于密封退火和填充间隙的切口

这种酶混合物的重要部分是它们都可以在相同的温度下工作,因此整个反应需要一个小时或更短的时间才能在 50 °C 下完成。一小时左右后,样品立即准备好转化为感受态细胞。酶的主混合物可以从公司购买(例如 NEB 或 SGI-DNA),也可以自己混合(例如参见米勒实验室协议)。Gibson 组装过程可用于在一个步骤中组装多达 6 个片段,从而实现无疤痕组装,不需要特定限制位点的存在(或缺乏),也不需要严格的时间承诺。另一个优点是该过程可以轻松地同时生成野生型和突变体构建体,而不是依次生成。

Gibson 装配如何工作?

相邻片段之间所需的同源性可以通过使用包含适当同源序列的引物进行 PCR 扩增来创建。NEB 建议重叠 15-40 bp,引物熔解温度大于 48℃。Snapgene 和 NEB 都有工具可以帮助您设计用于 PCR 扩增片段的引物,以整合此类同源区域。该视频 对如何使用Snapgene 的程序为 Gibson Assembly 设计引物进行了有用的演示。

对于使用 Gibson 组装的简单示例,假设您要将感兴趣的基因插入带有大标签的载体中在 N 端,但您没有在要使用的载体中包含标签。如果您通过限制酶克隆插入这两个 DNA 片段,则必须分两步进行,并且两个片段之间可能会留下疤痕。然而,通过使用 Gibson 组装,您可以一步将目标基因和标签序列插入载体,而不会留下疤痕,如下图所示。首先,您需要设计引物来扩增两个片段,同时还要包括与载体或相邻片段的同源区域。然后您将通过 PCR 扩增片段和载体,验证您的条带大小正确,并纯化 DNA 片段。最后,您只需将这三个片段与 Gibson assembly master mix 一起孵育 1 小时,然后转化为感受态细胞。该反应的成功率通常相当高,因此通常不需要筛选大量菌落。除去获取引物所需的时间,您可以在 5 天内完成构建。

Gibson 组装技术的一个缺点是该过程最适合超过 200 个核苷酸的片段。这可能是因为核酸外切酶可以在退火和聚合步骤发生之前咀嚼短于 200 个核苷酸的整个片段。其次,如果片段的末端具有稳定的单链 DNA 二级结构,例如发夹或茎环(可能会出现在终止子序列中),则效果不佳,因为这会直接与所需的相邻组装片段的单链退火和引发。

Gibson 组装常用于合成生物学,主要是因为在一个步骤中组装多个片段很容易,最终产品中没有留下疤痕(scar)序列。与限制性消化留下的较小重叠序列相比,片段之间的长重叠区也更好地确保了片段的正确组装顺序。2013 年的一项研究发现,Gibson 组装是最常用的组装方法之一(Kahl 2013)。然而,Gibson 组装对于依赖于实验之间重复使用部件的合成生物学标准来说并不理想。在 Gibson 组装中,必须为每个片段设计和排序长引物,并且对每个片段以及您想要在它旁边的片段具有特异性,因此这不允许混合和匹配许多不同的片段。解决此问题的一种方法是使用具有重叠区域的标准序列的组合,例如在MODAL(带有接头的模块化重叠定向组装)的情况下,它为重叠定向方法带来了模块化(Casini 2014)。在这种情况下,在同源区域之前添加接头序列,这允许部件的混合和匹配。

Gibson 组装遇到 CRISPR

Gibson 可以适应更复杂的克隆方案,例如那些您要使用的载体非常大、GC 含量高、包含大量重复序列——其中任何一个都可能使 PCR 步骤变得困难——或没有方便的线性化限制位点。这是将 Gibson 组装与流行的CRISPR 技术结合使用的完美案例,并在 Lockey 实验室最近的一份出版物中进行了描述 ( Wang, et al. 2015)。在这种情况下,不是使用限制酶或 PCR 来制作线性化载体,而是使用 Cas9 酶和特定的 gRNA 来切割 22kb 载体。当遵循上述标准 Gibson 组装技术时,这导致直接和无缝克隆到没有其他方法可用的载体中。最近还描述了使用 Gibson Assembly 和 CRISPR 的第二个例子(Jiang et al. 2015),其中非常大的细菌染色体片段(最多 100 kb)通过 CRISPR 被特异性切割,然后使用 Gibson 组装组装成载体。在这种情况下,载体被 PCR 扩增以包含与细菌染色体片段同源的区域。CRISPR 切割用于规避 PCR 扩增染色体片段的需要,这在技术上具有挑战性。

其他基于同源性的技术

我们在之前的 Plasmids 101博文中描述了序列和连接独立克隆 (SLIC)。尽管 SLIC 可能更具成本效益,但 Gibson 组装在 SLIC 方法的两个方面进行了改进。首先,它使用专用的 5’ 核酸外切酶,而不是使用 T4 DNA 聚合酶的核酸外切酶功能,后者必须由 dNTP 的存在或不存在来控制。其次,在 Gibson 组装中,添加连接酶以在体外修复切口,而在 SLIC 中,这些构建体在体内修复,最终效率低得多。

除了 SLIC 和 Gibson 之外,还描述了更多基于同源性的组装方法——CPEC(环状聚合酶延伸克隆)和 SLiCE(无缝连接克隆提取物,Seamless Ligation Cloning Extract),另外还有两个。同样,有几种商店购买的克隆试剂盒可用,它们都是基于长重叠区域的,不需要限制酶,片段之间没有疤痕序列。其中一些产品包括:

  • GeneArt® Seamless Cloning and Assembly (Thermo Fisher Scientific)
  • NEBuilder® HiFi DNA Assembly (NEB)
  • Cold Fusion Cloning (System Biosciences)
  • In-fusion Cloning (Clontech)

尽管这些套件的价格可能很高,但它们的制造商吹嘘其效率高且时间短。这些试剂盒还附带特定的方案、产品与插入物的比例建议以及引物设计工具,因此最好查阅您将使用的试剂盒的特定制造商的说明。其中一些产品可能具有 Gibson 组装所没有的优势,例如提高效率、缩短孵育时间或能够容纳更小的片段。

了解您的克隆方法

还有另外两种常见的克隆方法,它们很容易与 Gibson 组装混淆(它们都以 G 开头!),但实际上它们的工作方式截然不同。Golden Gate 克隆确实导致片段的无缝连接,但使用位点特异性限制性位点(IIS 型限制性内切核酸酶)切割识别序列外的 DNA。这要求载体和 DNA 片段在正确的位置而不是在插入片段的中间包含这些位点。网关克隆利用λ整合酶催化DNA部分的定向克隆,这些部分的两侧是整合酶识别的attB和attP位点的正交版本。这种方法需要包含这些整合位点的专门载体,并在片段之间留下疤痕,但允许 DNA 片段从一个载体轻松移动到另一个载体。

现在有很多不同的克隆方法。Gibson 和其他基于长同源性的克隆方法是标准限制/连接、Gateway 或 Golden Gate 克隆方法的有用替代方法。无论是用于常规克隆、多个片段的组装,还是合成生物学,您都应该考虑尝试一下!

参考资料

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