【2.2】金门克隆 Golden Gate Cloning

Addgene 的质粒可用于多种基于限制酶的克隆方法。每种方法都有其优缺点,但金门克隆在合成生物学和基因组工程领域都特别有用。我们将向您介绍如何将这个精确且易于使用的系统应用于您的克隆工作。

Golden Gate 克隆技术依赖于 1996 年首次发现的 IIS 型限制性内切酶。 IIS 型限制性内切酶与“传统”限制性内切酶的独特之处在于它们在识别序列之外切割,产生四个碱基侧翼突出端。由于这些突出端不是识别序列的一部分,因此可以定制它们以指导 DNA 片段的组装。如果设计正确,识别位点不会出现在最终构建体中,从而实现精确、无疤痕的克隆。

克隆方案如下:目的基因设计有位于切割位点外侧的 IIS 型位点(如 BsaI 或 BbsI)。因此,这些位点通过消化/连接被消除,并且不会出现在最终构建体中。目标载体包含具有互补突出端的位点,可指导最终连接产物的组装。如下所示,可以将具有 5’ 突出端 TGGA 和 3’ 突出端 TCCG 的片段连接到包含这些突出端的载体中。入口 DNA 悬垂可能存在于原始质粒中(选项 1)或使用基于 PCR 的扩增(选项 2)添加。

金门克隆的优势

就操作时间而言,Golden Gate 克隆是最简单的克隆方法之一,因为消化和连接可以在一个 30 分钟的反应中完成。目的载体和入口载体置于一个含有 IIS 型酶和连接酶的管中。尽管原始目标向量 + 插入可能会自发地重新连接,但这种临时构造保留了功能性 IIS 型位点并将被重新消化。相反,所需连接产物的形成是不可逆的,因为该构建体不保留酶识别位点。因此,连接过程的效率接近 100%。金门克隆的另一个优势是它的可扩展性。独特的 4 个碱基突出可用于组装多个片段 - 通常在单个反应中组装多达 10 个片段!这些突出端指定了所需的片段顺序,连接后酶识别位点的丢失有利于目标构建体的形成。尽管效率可能会随着片段数量的增加或非常小/非常大片段的连接而降低,但可以通过筛选更多数量的潜在克隆来克服这些问题。与金门组装相比,金门组装有一些优势其他克隆方法。基于外切核酸酶的方法(如Gibson 组装)需要 DNA 片段末端有 20-40 bp 的同源性来指定组装顺序,因此具有 5’ 或 3’ 序列同源性的片段无法使用此方法组装,但可以使用 Golden Gate 组装。流行的Gateway 克隆系统产生带有 attB 重组疤痕的结构,编码八个氨基酸,但 Golden Gate 组装可以设计为无疤痕。金门组装也比许多商业克隆方法便宜。

金门与合成生物学

合成生物学家已将金门克隆的强大功能用于模块化克隆策略。有时也称为 MoClo,该策略使用 IIS 型限制性内切酶 BsaI 和 BpiI/BbsI 一次高效组装多达六个 DNA 片段。与所有基于金门的方法一样,该系统利用 IIS 型酶切割其识别位点外的能力,并允许有效组装具有兼容突出端的 DNA 片段。科学家可以设计出独特的酶识别位点,这些位点以相反的方向位于 DNA 片段的两侧。这允许在单个反应中以正确的顺序组装多个 DNA 组件(启动子、基因、终止子等)。 有关详细的金门协议以及有用的提示和技巧,请参阅 Sainsbury Lab 网站 或 Engler & Marillonet 。

金门与基因组工程

2011 年初,Bogdanove 和 Voytas 小组描述了一种新的基于金门的 基因组编辑技术,该技术允许多个 DNA 片段的有序组装以创建 TAL 效应核酸酶。这些质粒旨在利用 BsaI 和 BsmBI 类型 IIS 位点,以便 只需几个步骤即可快速有效地构建定制的 TAL 阵列。 最近,CRISPR 技术采用了 金门克隆技术,可 将指定 gRNA 目标序列的适当寡核苷酸插入包含 Cas9 的质粒(如pX330)中。这种克隆策略不仅可以轻松创建单个 gRNA 表达质粒,而且还可以用于表达多个 gRNA。Addgene 提供两种基于 Golden Gate 的 gRNA 组装方法,可让您高效地将多达 7 个 gRNA 克隆到一个目标载体中,从而轻松实现多重化。

金门克隆的缺点

Golden Gate并非100%不依赖于序列,为避免预料之外的酶切,IIS型限制酶识别位点不能存在于所连接的片段内部。解决这个问题的方法是改造目的片段,通过PCR扩增在片段内识别位点上创造沉默的点突变,用IIS型限制酶特异性酶切PCR产物并在退火步骤后得以连接。如果目的基因和destination载体内部含有多个限制位点则有可能不能改造,需要考虑使用Gateway克隆或者Gibson连接。

另一个需要注意的是粘性末端的设计,虽然理论上可以有256种不同的切割序列,但是只通过一个不同的碱基区分不同的序列可能会产生错误的产物。

不管用于上述何种应用,Golden Gate克隆无疑是一种能在一个简单且高效的步骤中完成克隆复杂载体的强大工具。

参考资料

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