【2.1.2】同源重组克隆

然而传统的TA克隆存在诸多缺点,比如实验周期较长、受片段上的酶切位点影响等等。而同源重组克隆技术可以完美的解决这些缺点。 同源重组克隆技术是在重组酶的作用下,通过识别同源臂上的同源序列,可以将外源片段直接重组到载体上的克隆技术。

图二 同源重组原理图

同源重组克隆技术 在进行TA克隆构建重组质粒时,需要考虑外源片段上是否有需要用到的酶切位点,如果有的话,则在后续进行双酶切时会对片段进行酶切,因此无法正确的构建重组质粒。而同源重组克隆技术进行构建质粒时,是不需要对片段进行酶切的,因此无需考虑片段上的酶切位点。

在进行同源重组克隆时,设计的引物由两部分组成,分别为同源臂和基因特异性引物,其中同源臂为载体框架上的带酶切位点的序列。扩增出的带有同源臂的片段后需要与线性化载体进行重组。线性化载体可以通过双酶切或者反向PCR扩增得到。重组反应需要在重组酶的说明书下进行。

一、同源重组

同源重组是指含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

无论何种DNA序列,只要有足够的相似区域,就可以重组。但是当序列较短时,重组率会降低。因此,在构建重组载体时假阳性较双酶切法高。在真核生物中,同源重组不仅保证减数分裂中染色体的分离(染色体数目),也常常引起两个同源秦代染色体间基因的交换(姐妹染色单体交换)另外,同源重组还具有启动和进行DNA修复的功能

二、同源重组克隆

  1. 不需要TA克隆,省掉很多个步骤。
  2. 只需要单酶切,以保证酶切后的载体都是单一的线性片段,使得后续的重组连接更准确。(图中用Hind III酶切pMIR reporter,使得pMIR reporter成为两端都带着Hind III位点的线性载体) 3 . 重组酶的重组能力强于T4 DNA连接酶的连接能力,因此一般只需要一步即可重组连接成功,因此可以在重组反应之后进行测序鉴定。但是假阳性较高,考虑到同源重组在生物体中发生的作用,是可以理解的,而且因为构建载体时,发生同源重组的片段很小,所以嗯。

注意:

  1. 酶切法设计引物时,要考虑酶切位点和相应的保护碱基
  2. 同源重组中上游引物的5’端加入HindⅢ及该酶切位点前约15个碱基的载体序列,下游引物的5’端前面加的是Hind III酶切位点及该酶切位点在载体中对应后面的15个碱基载体片段。(保证目的片段插入载体的方向)

参考资料

个人公众号,比较懒,很少更新,可以在上面提问题,如果回复不及时,可发邮件给我: tiehan@sina.cn