【1.4.3】诱导型启动子(inducible promoters)

启动子控制 RNA 聚合酶和转录因子的结合。由于启动子区域驱动目标基因的转录,因此它决定了基因表达的时间,并在很大程度上决定了将产生的重组蛋白的数量。许多常见的推动者。像 CMV、EF1A 和 SV40 启动子一样,总是活跃的,因此被称为组成型(constitutive )启动子。其他的仅在特定情况下才活跃。在这篇文章中,我们将讨论可诱导 启动子,它可以从OFF状态切换到ON状态,以及如何在研究中使用这些启动子

一、诱导型启动子是如何调控的?

诱导型启动子可以通过阳性或阴性对照进行调节。

1.1 阳性诱导

在关闭状态下,启动子没有活性,因为激活蛋白不能结合。在诱导物与激活蛋白结合后,激活蛋白可以与启动子结合,将其打开并启动转录。

1.2 阴性诱导

在关闭状态下,启动子是无活性的,因为结合的阻遏蛋白会主动阻止转录。一旦诱导物与阻遏蛋白结合,阻遏蛋白就会从 DNA 中去除。当阻遏蛋白不存在时,转录开启。

二、诱导型启动子的类型 types of inducible promoters

化学试剂、温度和光都是可导致启动子诱导的因素的例子。下面,您将找到这三种诱导型启动子的简短描述,以及每种类型的示例。许多这些启动子系统都可以在 Addgene 上获得!

2.1 化学诱导启动子

化学调节的启动子是最常见的诱导型启动子之一。阳性诱导型四环素 ON ( Tet-On ) 系统是一种开发用于原核生物和真核生物的多功能工具,通过直接激活起作用。在该系统中,激活剂 rtTA(反向四环素控制的反式激活剂)通常是无活性的,不能与启动子中的四环素反应元件 (TRE) 结合。四环素及其衍生物用作诱导剂以允许启动子激活。

最常用的原核启动子之一是负诱导型 pLac 启动子。该启动子需要去除lac 阻遏蛋白(lacI 蛋白)才能激活转录。在乳糖或乳糖类似物 IPTG 存在的情况下,lac 阻遏蛋白发生构象变化,将其从启动子内的 lacO 位点移除并停止对靶基因的阻遏。在许多细菌表达载体中发现了一个简化的 lac 诱导系统。

负诱导型启动子 pBad 是另一种流行的原核启动子,常用于细菌蛋白质纯化。当不存在阿拉伯糖时,调节蛋白 AraC 会结合 pBad 上游的 O 和 I1 位点,从而阻断转录。添加阿拉伯糖导致 AraC 结合 I1 和 I2 位点,从而开始转录。除了阿拉伯糖,与 cAMP 激活蛋白 (CAP) 复合的 cAMP 也可以刺激 AraC 与 I1 和 I2 位点结合。用葡萄糖补充细胞生长培养基可降低 cAMP 并抑制 pBad,从而减少启动子渗漏。

化学诱导型启动子的其它实例包括正诱导醇和类固醇在植物研究常用的调节的启动子

2.2 温度诱导启动子

温度敏感的表达系统通常比化学诱导的启动子泄漏(leaky)更少;它们在常规温度下表现出接近零的表达,但可以通过热或冷暴露诱导。例子包括热休克诱导型 Hsp70 或 Hsp90 衍生的启动子,其中选择的基因仅在暴露于短暂的热休克后表达。在 Hsp70 的情况下,热休克释放热休克因子 1 (HSF-1),其随后与启动子中的热休克元件结合,从而激活转录。Addgene 保藏者开发了热休克诱导型Cre和Cas9,以便在秀丽隐杆线虫和果蝇等物种中轻松进行基因组工程。

2.3 光诱导启动子

光是激活基因表达的另一种方式,合成生物学中使用的双组分系统使用光来调节转录。红焰质粒 pDawn含有蓝光感应蛋白 YFI。当光不存在时,YFI 磷酸化 FixJ,它与 FixK2 启动子结合以诱导噬菌体阻遏物 cI 的转录。阻遏物 cI 抑制噬菌体启动子 pR 的转录,阻止报告基因的表达。当有光时,YFI 处于非活性状态,阻止阻遏物 cI 合成并允许报告基因转录。Addgene 还拥有由 Tabor 实验室设计的黄色火焰光调节的两个组件系统。

三、哪种诱导型启动子适合我?

以下是选择诱导型启动子时要考虑的一些重要变量的列表。

3.1 实验系统

由于转录机制因细胞类型或生物体而异,因此启动子也同样可变。细菌启动子仅在原核细胞中起作用,并且通常仅在它们所源自的相同或密切相关的物种中起作用。同样,各种真核细胞类型(哺乳动物、酵母、植物等)需要独特的启动子,并且很少有交叉。感应机制还必须与您的实验系统兼容。

3.2 漏气 Leakiness

如果您要表达可能有毒的基因,重要的是您的诱导型启动子不要泄漏太多。对于诱导型原核启动子,已知 pLac 有轻微渗漏,而 pBad 可能是更好的选择,因为表达可以被葡萄糖抑制。温度诱导型启动子也因其低渗漏性而闻名。

3.3 诱导水平

您希望在多大程度上诱导目标基因的转录?诱导型启动子的强度可以有很大差异。如果您正在寻找高诱导性,Tet-On 系统可能是一个不错的选择,因为它被记录为在激活时诱导转录 > 1,000 倍。

3.4 滞后时间

诱导给定启动子所需的时间各不相同。只需要添加外部诱导剂的启动子,如 Tet 系统,可能会被非常迅速地激活。相比之下,由于转录/翻译所需的时间,需要阻遏物/诱导物转录的启动子系统将具有更长的滞后时间。

参考资料

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