【3.2.3】慢病毒质粒

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慢病毒是将您感兴趣的基因引入细胞的有用且有效的工具。与只能感染分裂细胞的伽马逆转录( gamma-retroviruses)病毒不同,慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞。

Addgene 拥有广泛的慢病毒质粒集合,可用于各种应用,包括 cDNA 表达、shRNA 介导的敲低、Tet 和 Cre 调控的表达、CRISPR 基因组编辑等。毫不奇怪,我们从世界各地的科学家那里收到了许多问题,他们正在寻找有关这些载体的更多信息或澄清。继续阅读以找到我们最常见的慢病毒问题的答案。

这个有用的资源 来自 Addgene Depositor(和慢病毒专家)Didier Trono 的实验室网页解释了如何通过共转染三种基本成分来生产慢病毒颗粒:慢病毒包装载体、包含目标基因的转移载体和编码包膜的质粒。多年来,已经基于 HIV-1 开发了三代慢病毒包装系统;然而,第一代载体从未使用过,因为它们对科学家构成了太大的生物安全风险。对于大多数实验来说,第二代载体可能就足够了;然而,第三代包装系统为该技术提供了最大的生物安全性。使用第三代系统的次要限制是它涉及将四种不同的质粒转染到生产细胞中(两个包装质粒、一个包膜质粒和慢病毒转移载体),而不是用于第二代系统的三个。

经常问的问题

现在让我们深入了解一些细节,并回答我们在 Addgene 最常被问到的问题:

Q1:逆转录病毒和慢病毒是一回事吗?我可以用逆转录病毒包装质粒包装慢病毒吗(反之亦然)?

A1:慢病毒属于逆转录病毒家族。科学家们通常所说的“逆转录病毒”在技术上是伽马逆转录病毒——逆转录病毒家族的另一个独立成员。虽然慢病毒和 γ 逆转录病毒都使用相同的基因进行包装(即 gag、pol 和 env),但这些蛋白质的同种型以及病毒长末端重复序列 (LTR) 是不同的。因此,慢病毒和逆转录病毒包装载体不可互换。虽然这些差异可能看起来很微妙,但它们导致慢病毒和逆转录病毒之间存在关键的生理差异。慢病毒能够进入完整的核膜,使它们能够感染分裂细胞和非分裂细胞,而逆转录病毒只能感染分裂细胞。在选择合适的基因传递系统时,需要考虑特定的靶细胞或组织。

Q2:我可以使用慢病毒转移载体进行瞬时转染吗?

A2:从技术上讲,是的。它真的会起作用吗?那要看。大多数转移质粒使用弱病毒 LTR 启动子来驱动目标基因的表达。因此,蛋白质表达水平往往远低于使用专为瞬时表达设计的质粒骨架时所见的水平(在此处找到一些有用的骨架) 或来自病毒转导。虽然并不理想,但病毒构建体的瞬时表达是一种有用的工具,因为它提供了一种在投入时间和资源制作稳定细胞系之前快速检查构建体是否具有功能的方法。当瞬时表达病毒构建体时,需要注意确保使用正确的细胞系;包括 293 在内的几种常见实验室细胞系用腺病毒蛋白 E1A 永生化,该蛋白已被证明可抑制 HIV-1 LTR 的表达(更多信息可在此处获得)。

Q3:如何区分第二代和第三代传输向量?

慢病毒遗传组织A3:Addgene 根据它们是否具有嵌合 5’LTR 来定义第 2 代或第 3 代转移载体。第二代转移质粒具有野生型 5’LTR,这需要 Tat 蛋白的存在才能起作用,而第三代转移质粒具有嵌合 5’LTR,包括 CMV 或 RSV 启动子以及部分 5 ‘LTR。包含嵌合 5’LTR 可消除对 HIV Tat 蛋白的需求,从而降低在目标细胞中产生具有复制能力的慢病毒 (RCL) 的可能性。

第二代与第三代慢病毒质粒

Q4:第二代和第三代载体的包装系统有何不同?这对转移向量意味着什么?

A4: 慢病毒包装系统 在两个方面有所不同。首先,第二代系统由包膜质粒和编码 HIV 蛋白 gag、pol、rev 和 tat 的包装质粒组成。3个代系统需要包膜质粒,和两个包装质粒,一个编码gag和pol和第二编码转。其次,第三代包装系统修改了转移质粒的 5’ LTR 以消除对 HIV Tat 蛋白的需要,因此被认为更安全。

第二代转移质粒必须与第二代系统一起包装,因为野生型 5’LTR 启动子需要 Tat 才能发挥作用。第三代质粒可以与任一系统一起包装。请注意,用于打包病毒的世代不会改变转移载体的世代。

Q5:病毒颗粒上会表达什么包膜糖蛋白?

A5:这取决于您使用的包膜质粒,因为包膜的选择决定了病毒的趋向性。VSV-G 因其广泛的宿主范围和更高的颗粒稳定性而非常常见;然而,该蛋白质具有细胞毒性,阻止了慢病毒载体在生产细胞系中的长期表达。识别毒性较小的包膜蛋白或靶向特定组织的包膜蛋白是活跃的研究领域(点击此处查看评论 )。替代包膜是强大的工具,因为它们允许研究人员将转导靶向特定的细胞类型或组织;这在需要针对特定​​细胞群子集的基因治疗应用中非常有用。

Q6:转移质粒是否有复制能力?什么是罪(SIN)?

A6:大多数(如果不是全部)Addgene 转移质粒是复制缺陷型的,这意味着它们可用于制造能够感染靶细胞的病毒,但在初始感染后不能产生任何新的病毒颗粒。

SIN是简写 self-inactivating,这是通过在转移质粒删除3’LTR的很大一部分来实现的。删除可防止在靶细胞中产生全长病毒 RNA,并将产生 RCL 的风险降至最低。此外,删除通过限制病毒 LTR 增强子和转基因之间的相互作用来降低插入诱变的风险;这种相互作用不仅可以改变转基因的表达,还可以改变相邻细胞基因的表达。

Q7:哪些基因被删除或修改导致复制缺陷?百分之多少的载体成分是基于 HIV 的?

A7:没有一个质粒包含产生病毒颗粒所需的所有成分。组件划分如下:

  • 转移载体包含最少的顺式作用 HIV 成分:LTR、PPT、RRE 和 psi 包装信号。病毒成分的总量通常小于 1.5kb,很少超过转移质粒的 30%。许多传输向量是 SIN。
  • 包装质粒包含病毒生产所需的最少数量的 HIV 基因(3 或 4)。第三代向量包含 gag、pol 和 rev。第二代包含这三个基因加上 tat。
  • 包膜质粒为假型分析提供了异源包膜,并且不是源自 HIV

关于慢病毒转导的安全性

Q8:你提到了生物安全。慢病毒在生物安全方面的主要风险是什么?

A8:根据美国生物安全协会的说法,“慢病毒载体的两个主要风险是:1) 可能产生具有复制能力的病毒 [通常是 HIV-1];以及 2) 通过插入诱变潜在的致癌作用。这些风险是主要基于使用的载体系统和载体编码的转基因插入物。”

下表分解了与慢病毒转导各个方面相关的生物安全问题,以及有关如何降低风险的建议。

对于正在执行的特定实验,应始终考虑生物安全性,并且您应该了解您所在机构或国家/地区概述的使用此类试剂的指南。

参考资料

个人公众号,比较懒,很少更新,可以在上面提问题,如果回复不及时,可发邮件给我: tiehan@sina.cn

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