【4.6】荧光素酶(Luciferase)

萤光素酶(Luciferase)是一类能够催化活生物体中导致光子发射的化学反应的酶。对于大多数人来说,最熟悉的生物发光生物是萤火虫(Photinus pyralis),也许它也是最常用的生物发光报告基因也就不足为奇了。这种甲虫发出黄绿色光,峰值发射波长为 560nm。在 1985 年发表第一篇描述萤火虫萤光素酶克隆的文章后不久,几项研究利用萤光素酶作为植物和哺乳动物细胞中的遗传报告基因。荧光素酶检测已成为基因表达分析和荧光素酶基因的金标准 (许多可供选择的一个)现在是报告质粒的一个共同特征。

报告基因检测 Reporter gene assays

报告基因,例如萤光素酶,通常作为细胞内转录的指示剂,在其中测量报告蛋白或其酶活性的检测。启动子或增强子区域对基因表达的影响可以通过在特定检测中检测报告基因来确定,理想情况下,该检测具有低背景信号、高灵敏度,当然快速、准确和安全。在荧光素酶测定的情况下,光子发射是由需要荧光素、ATP 和氧作为底物的化学反应催化产生的。这种生物发光报告基因产生光子的速度比基于荧光的方法慢,例如绿色荧光蛋白 (GFP) 的激发因为与使用高强度激光快速激发 GFP 相比,化学反应的性质。由于产生光子的机制不同,化学发光报告分子通常不如荧光蛋白亮,但具有背景水平较低和信号灵敏度提高的优势,因为光子是简单地测量的 —— 它们不需要启动反应。表 1比较了发光与荧光的一些一般优缺点。

荧光素酶的生物来源

尽管从萤火虫甲虫 ( Photinus pyralis ) 中分离出的荧光素酶是最常用的生物发光报告基因,但已经在具有不同动力学、底物要求和光子发射波长的不同物种中发现了其他荧光素酶。来自海三色堇 ( Renilla reniformis )的海肾荧光素酶在催化与底物腔肠素的化学反应时发出蓝光,峰值发射波长为 480nm,可能是第二种最常用的荧光素酶。从荧光素酶已经从克隆其他生物包括叩头虫(引火plagiophthalmus),铁路蠕虫(Phrixothrix hirtus),以及各种海洋甲壳类动物。许多这些荧光素酶已经过进一步改造以改进天然酶的特性,这些特性总结在下表2中。

表达荧光素酶的质粒的常见用途

荧光素酶报告基因检测 Luciferase reporter assay

典型的含有荧光素酶的质粒最常用于研究调控元件的影响,例如启动子、增强子和非翻译区,或这些调控元件的突变对基因表达的影响。将调控元件(野生型或突变型)克隆到质粒中荧光素酶基因的上游,然后将其导入所需的哺乳动物、植物或细菌细胞。荧光素酶作为报告基因的表达是通过其产生光的活性来测量的,通常使用光度计或闪烁计数器,然后可以使用活性测量来量化调节元件的效果。根据所使用的特定荧光素酶,必须为酶提供相容的底物以催化发光反应。许多荧光素酶检测需要细胞裂解作为破坏细胞膜和输送底物的最有效方法;然而,分泌的荧光素酶或使用替代底物试剂可以测量活细胞的发光。

监测 miRNA 敲低 Monitor miRNA knockdown

荧光素酶的表达可以作为对目标序列上 miRNA 效率的下游测量进行监测。将感兴趣的基因克隆到含有终止密码子的荧光素酶下游的质粒中,然后将其转染到所需的细胞中。含有荧光素酶和目标基因的杂交 mRNA 转录物允许功能性荧光素酶翻译,直到 miRNA 靶向并降解 mRNA 序列,导致荧光素酶活性降低。该实验方案可以很容易地筛选 miRNA 的有效性。

分析细胞信号通路 Analyze Cell Signaling Pathways

可以使用荧光素酶活性作为信号活性的量度,在高通量筛选中研究已知的细胞信号通路。多个响应元件被克隆到与荧光素酶连接的最小启动子上游的质粒中。该途径的激活将导致荧光素酶表达,并且可以设计更复杂的细胞处理以进一步探索该途径。

参考资料

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