【3.1.1】哺乳动物载体

尽管质粒在哺乳动物中并不自然存在,但科学家们仍然可以从使用合成载体和培养的哺乳动物细胞进行基于质粒的研究中获益。当然,这些哺乳动物载体必须与它们转染的细胞类型兼容—— 例如,细菌复制起点 (ORI)不允许在哺乳动物细胞中进行质粒复制,杀死细菌的毒素可能没有任何可辨别的对哺乳动物细胞的影响。在这篇博文中,我们将讨论哺乳动物质粒与细菌质粒的不同之处,包括复制如何发生以及是否需要对转染细胞进行选择。

在进入哺乳动物质粒成分之前,描述引入遗传物质的方法(例如质粒) 进入哺乳动物细胞,这一过程称为转染(transfection)。转染有点类似于细菌转化(transformation)(将 DNA 引入细菌细胞);然而,技术和试剂各不相同。将质粒转染到哺乳动物细胞中是相当简单的,所得细胞可以瞬时表达质粒 DNA(类似于细菌)或将遗传物质直接整合到基因组中以形成稳定的转染。与细菌转化不同,科学家不会“选择”以相同方式摄取质粒的细胞。选择方法,如下所述,通常在创建稳定细胞系时使用,不用于一般质粒选择。相反,报告基因通常用于轻松监测细胞中的转染效率和表达水平。理想情况下,所选择的报告基因是细胞独有的,由质粒表达,可以方便地进行检测。对您感兴趣的基因进行直接测试可能是评估转染成功的另一种方法。GFP 经常被用作报告,我们将在稍后的帖子中介绍这种用途广泛的荧光团,敬请期待!

瞬时转染和难以捉摸的“哺乳动物 ORI”

对于许多实验,转染的质粒被瞬时表达就足够了。由于在转染过程中引入的 DNA 没有整合到核基因组中,在没有质粒复制的情况下,外源 DNA 会随着时间的推移而降解或稀释。但是,这可能不是问题,具体取决于实验的持续时间或其他参数。哺乳动物细胞以比细菌慢得多的速度翻倍(分别为约 24 小时和 20 分钟)。因此,确保质粒在细胞中复制并不总是关键任务,因为许多实验都是在转染 48 小时内完成的。

当然,您可能不想耗尽质粒,但仍想使用瞬时转染方法。由于没有“天然”哺乳动物 ORI,科学家们篡改了基于病毒的 ORI 来填补空白。然而,这些 ORI 需要在细胞内以反式表达的额外成分才能有效复制。表达 Epstein-Barr 病毒 (EBV) 核抗原 1 (EBNA1) 或 SV40 大 T 抗原(293E 或 293T 细胞)的细胞系允许分别对含有病毒 EBV 或 SV40 ORI 的质粒进行游离扩增。这些病毒成分的存在大大降低了质粒稀释率,但不能保证 100% 的转染效率。

稳定转染

稳定转染用于创建一个细胞群,这些细胞已完全并成功地将外来遗传物质整合到其基因组中。与用于在酵母和细菌中表达的质粒不同,用于稳定转染的质粒很少包含 ORI,因为整合的 DNA 将作为基因组的一部分进行复制。由于外源 DNA 成为宿主基因组的永久添加物,细胞将不断表达外源物质的遗传特征,并随后将其传递给后代。稳定转染的细胞可以被认为是来自原始亲本细胞的全新细胞系。

哺乳动物细胞中的阳性选择

为了实现稳定的转染,应该有一个选择性压力来迫使细胞将质粒 DNA 整合到基因组中。出于本文的目的,我们将正选择定义为获取阳性性状的手段(即质粒包含一个使细胞对毒素具有抗性的cassette),而阴性选择则是获取阴性性状(即质粒包含一个使细胞对毒素敏感的cassette)。在下表中,我们专注于正选择;然而,负选择技术可以与正选择结合使用,以确保您的基因定位到基因组内的特定位置。

哺乳动物细胞中的阳性选择与细菌中的阳性选择类似,下表列出了最常用的选择标记:

请记住以下提示:

  • 在哺乳动物细胞中没有一种推荐浓度可供选择。在进行转染实验之前,确定有效选择所需的适当浓度非常重要。这通常是通过执行“杀死曲线”(kill curve)(基本上在不同浓度的选择试剂中生长细胞)来实现的。细胞应在 3-5 天内死亡,抗性菌落会在大约 10-14 天内出现,具体取决于细胞分裂的速度。

  • 庆大霉素通常用作哺乳动物细胞培养中的补充剂以抑制细菌生长,不适合哺乳动物选择- 不要将其与 G418(又名遗传霉素)混淆。

  • 新霉素不应用于哺乳动物表达—— 而是使用 G418。这可能会令人困惑,因为 neo/kan 基因赋予 G418 抗性;然而,与庆大霉素一样,新霉素通常用于抑制细菌生长。

  • 在创建稳定的细胞系时,在转染后 24-48 小时之前不应将选择剂添加到培养基中。

参考资料

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