【1.6.1】甲基化和限制酶

您是否曾尝试过用 XbaI 或 ClaI 限制性内切酶进行消化并获得异常或意外的结果?或者考虑过为什么 DpnI 会降解来自PCR 反应的模板 DNA,而不是来自定点诱变实验的新合成产物?这两个问题的答案都是一样的——甲基化!请阅读下文,了解DNA甲基化会如何影响你的Restriction digests 。

为什么要甲基化?

  • 限制性内切酶在实验室中如此普遍,以至于人们很容易忘记这些酶天然存在于细菌中,用于克隆或确认质粒以外的目的. 事实证明,限制性内切酶是原核生物用来保护自己免受外来 DNA 侵害的天然限制性修饰系统的一部分。
  • 这些系统的另一个组成部分,甲基转移酶,在特定序列上甲基化 DNA,以防止它们被限制性内切核酸酶降解。

给定的原核生物通常具有编码一个或几个限制性修饰系统的基因,这些系统包含将甲基添加到特定 DNA 序列的甲基转移酶和识别和切割未甲基化的相同 DNA 序列的伴生核酸内切酶(例如,如果它来自噬菌体)。

除了限制性修饰系统之外,DNA 甲基化还在调节基因组复制、修复 DNA 合成过程中发生的错配碱基对或小插入缺失以及促进或抑制蛋白质表达方面发挥着不可或缺的作用。参与这些过程的甲基化酶(例如 Dam 和 Dcm 甲基化酶)独立于限制性修饰系统,但仍会影响某些限制性酶是否可以有效切割 DNA。

常见的实验室大肠杆菌K12 菌株(例如 DH5alpha)含有 3 种甲基化酶,可识别和甲基化不同的 DNA 片段:

  • Dam 甲基化酶在 DNA的 GA TC 片段的腺嘌呤上添加一个甲基
  • Dcm 甲基化酶向 C C WGG的第二个胞嘧啶添加一个甲基
  • EcoKI 甲基化酶在 A A CNNNNNNGTGC 或 GC A CNNNNNNGTT 中的腺嘌呤上添加一个甲基

对克隆和消化的影响 Impact on cloning and digests

尽管并非所有原核 DNA 的甲基化水平都相同,但在消化 DNA 时应考虑甲基化的可能性。为什么?好吧,尽管 Dam 甲基化位点与任何限制性修饰系统没有特别关联,但它们的序列可能与限制性位点重叠,抑制酶,如 ClaI 或 XbaI,或者相反,激活酶,如 DpnI。

例如,如果酶的识别位点 (TCTAGA) 在 GA 之前或之后是 TC,则 XbaI 的切割可能会由于甲基化而被阻止。如下图所示,Dam 甲基化酶识别位点(红色下划线)与 XbaI 切割位点(以橙色线表示)重叠,因为限制位点后面是 TC。在该位点添加甲基会阻止酶在那里切割 DNA,尽管其他限制性位点(包括其他不在 GA 之前或之后是 TC 的 XbaI 位点)将正常切割。如果不考虑,这个被阻止的站点可能会给您带来难以解释的结果或导致您得出质粒不正确的结论!

相反,诸如 DpnI 之类的酶需要在其识别位点进行甲基化以有效地切割 DNA。DpnI 常用于定点诱变。在此过程中,通过 PCR 将所需突变掺入您感兴趣的质粒会生成没有甲基化的突变质粒(PCR 反应中没有甲基转移酶)。另一方面,模板质粒应该来自 dam+ 大肠杆菌 菌株,因此在质粒中发现的任何GATC 序列中都会有甲基化的腺嘌呤 。当 PCR 产物用 DpnI 消化时,只有非突变和甲基化模板被破坏,留下一组突变质粒,以后可以通过 Sanger 测序进行验证。

我怎么知道我的酶是否会切割?

无论是出于克隆目的还是出于诊断目的进行消化,我们都建议仔细检查以确保您的结果不会受到甲基化的影响。方便的是,实验室中常用的大多数限制酶没有可能与甲基化位点重叠的识别位点。下面的快速参考表列出了 10 种可能受甲基化影响的常见酶。此表并非详尽无遗,因此您可能需要查阅REBASE 数据库以获取更多详细信息。

如果您的酶受到甲基化的影响,了解限制性位点周围的 DNA 序列可以帮助您快速预测这些位点中的哪些(如果有)将被甲基化。使用与上述相同的示例质粒(其 XbaI 位点被甲基化阻断),下图说明了序列可视化软件(我们在这里使用了 Snapgene)如何帮助您评估您的限制性位点是否会被甲基化阻断以及如何改变您预期的摘要结果。如果不考虑 Dam 甲基化,则 XbaI/NotI 消化会出现泳道 1 中描述的消化模式。但是,该程序允许您选择是否查找 Dam、Dcm 和/或 EcoKI 甲基化位点,并在所选酶位点被阻止时向您发出警告。

控制甲基化

最后,您可以通过改变细菌选择来控制甲基化。例如,如果您必须使用会被 Dam 或 Dcm 甲基化阻断的限制性位点,您可以通过首先将您的 DNA 克隆到dam– / dcm–大肠杆菌菌株(如JM110)中 并重新纯化它。这些特化的大肠杆菌菌株已被专门设计为缺乏 Dam 和 Dcm 甲基化酶,因此产生的 DNA 在这些位点未甲基化。请记住dam-/dcm- 菌株的突变率可能会增加(因为这些菌株也会缺乏 Dam 的错配修复功能),因此这些菌株不应用于长期储存。

参考资料

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