【3.1.3】多顺反子载体

在许多实验环境中,多个基因的共表达是有价值的。为实现这一目标,科学家们使用了多种技术,包括共转染两个或多个质粒、使用多个或双向启动子,或创建双顺反子或多顺反子载体。与为每个表达的基因创建独特的 mRNA 转录本的启动子不同,多顺反子载体同时表达来自同一 mRNA 的两种或多种不同的蛋白质。我们之前已经讨论过启动子 ,因此在这篇博文中,我们将介绍多顺反子载体的基础知识:它们为何有用、它们如何工作以及如何开始使用它们。

为什么要使用多顺反子载体?

检测表达您的基因的细胞,尤其是当您正在研究一个新基因时,并​​不总是一个简单的过程。科学家们并没有尝试直接检测您感兴趣的基因,而是开发了新方法来与报告基因(例如荧光基因或抗性基因)共同表达您的基因。这些报告基因使您可以轻松筛选或选择高水平表达您的目标基因的细胞。与从独特的启动子表达筛选或选择标记的载体不同,多顺反子质粒确保任何对您的标记呈阳性的细胞也应该表达您的基因,因为它们都来自相同的转录本。

当然,多顺反子载体不必专门用作检测手段;它们几乎在您想在同一细胞中表达多个基因的任何时候都非常有用。虽然可以通过使用具有多个单独表达盒的质粒来驱动共表达,但从同一盒表达基因有时是有利的,特别是当只有一部分质粒被包装用于病毒传递或相对表达时。两个或多个基因之间的水平很重要。

多顺反子载体如何工作?

科学家们“借用”了在阳性单链 RNA 病毒中发现的一些技巧,以允许从单个转录本中高效翻译多个基因。为研究目的最广泛纳入质粒的两种策略如下所述。

IRES 元素

真核生物中的翻译通常从 5’ 帽开始,因此每个 mRNA 只发生一个翻译事件。然而,一些双顺反子载体利用称为内部核糖体进入位点 (IRES) 的元件来允许从 mRNA 的内部区域开始翻译。

在上图中,您可以看到 IRES 元件充当另一个核糖体募集位点,从而导致来自单个 mRNA 的两种蛋白质的共表达。

IRES 最初是在脊髓灰质炎病毒 RNA 中发现的,它促进真核细胞中病毒基因组的翻译。从那时起,人们发现了多种 IRES 序列——许多来自病毒,但也有一些来自细胞 mRNA。它们的共同点是能够独立于 5’ 帽引发翻译起始。

IRES 元件非常有用,常见于双顺反子载体中;然而,它们确实有一些缺点。这些元件非常大 (500-600 bp),可能会在包装容量有限的病毒转移载体中占据宝贵的空间。此外,使用 IRES 元件一次表达两个以上的基因可能是不可行的。此外,科学家报告说,由于实验细胞类型和克隆到载体中的特定基因等因素,下游顺反子的表达较低。

双顺反子基因在许多实验环境中,多个基因的共表达是有价值的。为实现这一目标,科学家们使用了多种技术,包括共转染两个或多个质粒、使用多个或双向启动子,或创建双顺反子或多顺反子载体。与为每个表达的基因创建独特的 mRNA 转录本的启动子不同,多顺反子载体同时表达来自同一 mRNA 的两种或多种不同的蛋白质。我们之前已经讨论过启动子 ,因此在这篇博文中,我们将介绍多顺反子载体的基础知识:它们为何有用、它们如何工作以及如何开始使用它们。

为什么要使用多顺反子载体? 检测表达您的基因的细胞,尤其是当您正在研究一个新基因时,并​​不总是一个简单的过程。科学家们并没有尝试直接检测您感兴趣的基因,而是开发了新方法来与报告基因(例如荧光基因或抗性基因)共同表达您的基因。这些报告基因使您可以轻松筛选或选择高水平表达您的目标基因的细胞。与从独特的启动子表达筛选或选择标记的载体不同,多顺反子质粒确保任何对您的标记呈阳性的细胞也应该表达您的基因,因为它们都来自相同的转录本。

当然,多顺反子载体不必专门用作检测手段;它们几乎在您想在同一细胞中表达多个基因的任何时候都非常有用。虽然可以通过使用具有多个单独表达盒的质粒来驱动共表达,但从同一盒表达基因有时是有利的,特别是当只有一部分质粒被包装用于病毒传递或相对表达时。两个或多个基因之间的水平很重要。

多顺反子载体如何工作? 科学家们“借用”了在阳性单链 RNA 病毒中发现的一些技巧,以允许从单个转录本中高效翻译多个基因。为研究目的最广泛纳入质粒的两种策略如下所述。

IRES 元素 真核生物中的翻译通常从 5’ 帽开始,因此每个 mRNA 只发生一个翻译事件。然而,一些双顺反子载体利用称为内部核糖体进入位点 (IRES) 的元件来允许从 mRNA 的内部区域开始翻译。

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在上图中,您可以看到 IRES 元件充当另一个核糖体募集位点,从而导致来自单个 mRNA 的两种蛋白质的共表达。

IRES 最初是在脊髓灰质炎病毒 RNA 中发现的,它促进真核细胞中病毒基因组的翻译。1,2 从那时起,人们发现了多种 IRES 序列——许多来自病毒,但也有一些来自细胞 mRNA。它们的共同点是能够独立于 5’ 帽引发翻译起始。

IRES 元件非常有用,常见于双顺反子载体中;然而,它们确实有一些缺点。这些元件非常大 (500-600 bp),可能会在包装容量有限的病毒转移载体中占据宝贵的空间。此外,使用 IRES 元件一次表达两个以上的基因可能是不可行的。此外,科学家报告说,由于实验细胞类型和克隆到载体中的特定基因等因素,下游顺反子的表达较低。3

2A肽 2A Peptides

为了克服 IRES 元件的一些缺点,科学家们将“自切割”2A 肽改编成他们的多顺反子载体。这些肽最初是在小核糖核酸病毒中发现的, 很短(大约 20 个氨基酸)并且从相同的 mRNA 产生等摩尔水平的多个基因。术语“自我切割”并不完全准确,因为这些肽被认为是通过使核糖体跳过 2A 元件 C 端肽键的合成来发挥作用,从而 导致 2A 序列末端之间的分离和下一个肽下游。 “切割”发生在 C 端的甘氨酸和脯氨酸残基之间,这意味着上游顺反子将在末端添加一些额外的残基,而下游顺反子将从脯氨酸开始。

下表列出了科学家使用的四种常见的 2A 肽。2A 切割在真核细胞中是普遍存在的,尽管一些科学家报告说其中一些肽的切割率接近 100%,但尚未就哪种肽最有效达成共识。可能特定 2A 肽的选择最终取决于许多因素,例如细胞类型或实验条件。

我该如何开始?

如果您希望将您感兴趣的基因与荧光蛋白或选择性标记物共表达,最容易从已经克隆了多顺反子元件和报告基因的质粒开始。在这些质粒中,您只需克隆您的基因IRES 或 2A 元件上游或下游的多克隆位点(取决于报告基因的位置)。

Addgene 的集合提供了多种质粒来表达两个或多个基因,下面列出了其中一些。我们应该注意到这些载体主要是为双顺反子表达而设计的;然而,许多可以很容易地被操纵来表达两个以上的基因

对于多个独特基因的共表达,您可以从在多顺反子元件两侧具有多个克隆位点的质粒开始,或者您可以用您的一个或多个感兴趣的基因替换上述报告基因之一。上表中列出的一些质粒 (及其相关质粒)旨在替换一个或多个基因。

此外,2A 肽可以在您感兴趣的基因之间进行 PCR 克隆,然后您可以将整个多顺反子盒作为一个单元插入主链。虽然当需要化学计量等价的表达水平时,建议使用 2A 肽代替 IRES,但我们还应注意,IRES 和 2A 肽不是相互排斥的元素。实验室已成功利用同一多顺反子载体中的 2A 和 IRES 元件,有效地构建了一种构建体,该构建体在 IRES 荧光报告基因上游的等效水平上表达多个独特基因,以便于检测。

参考资料

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