【1.3】质粒复制起源

既然我们已经了解了抗生素抗性基因,让我们考虑任何质粒的另一个基本要素:复制起点/复制子 (replication/replicon)。复制子由复制起点 ( ori ) 及其所有控制元素组成。ORI是其中DNA复制的开始,使质粒复制本身,因为它必须在细胞内生存。

质粒的复制子通常与用于复制宿主染色体 DNA 的复制子不同,但它们仍然依赖宿主机器来制造额外的拷贝。 ori序列的 As 和 Ts 通常很高。你为什么问?好吧,AT 碱基对通过两个氢键保持在一起,而不是像 GC 对那样三个。因此,可以在较低温度下更容易地分离富含 AT 对的 DNA 片段,并允许复制机器室进入并忙于复制。

复制起点的类型 Types of origins of replication

那里有很多复制起点,所以为了简单起见,我们忽略了真核细胞和病毒中使用的那些,而只关注细菌中发现的那些。您可能会看到一些常见的包括 ColE1、pMB1(它们有一些略有不同但众所周知的衍生物)、pSC101、R6K 和 15A。并非所有复制源都是平等的。一些会产生许多质粒拷贝,而另一些会产生一些拷贝,这取决于它们的调节方式。通常,复制控制被称为“松弛”或“严格取决于是否” ORI 分别由 RNA 或蛋白质正调控。质粒的拷贝数与正负调控之间的平衡有关,并且可以通过复制子中的突变进行操作。例如,pMB1 ORI维护关于每个细胞20个拷贝,而的pUC - 其仅由两个不同的突变- 将产生将每个细胞的多达700份。

图 1:显示质粒标准特征的质粒图谱。

那么,你如何选择?Addgene 高级科学家 Marcy Patrick 说,研究人员可以先问自己几个问题:

  • 该质粒是否仅用于大肠杆菌?一般革兰氏阴性菌?革兰氏阴性和革兰氏阳性?
  • 您的细胞中是否一次只有一种质粒类型?
  • 你想制造很多质粒吗?
  • 该基因是否有毒?请记住,在适当的启动子和生长条件下,具有中低拷贝数的质粒仍然可以表达大量蛋白质

明智地选择您的复制起点并避免质粒不相容性

换句话说,ori的最佳选择 取决于您想要保留多少质粒拷贝、您打算使用哪个或哪个宿主,以及您是否需要考虑您的质粒与一个或多个其他质粒的兼容性。一般来说,具有相同ori 的质粒 是不相容的,因为它们会竞争相同的机器,造成不稳定和不可预测的环境。通常,来自同一组的质粒不应共同转化,因此如果您需要两个质粒进行实验,请确保它们具有“兼容”的ori ‘s。有关详细信息,请参阅下表。

影响质粒拷贝数的其他因素

尽管ori的序列和调控 极大地影响了质粒的拷贝数,但其他外部因素也有影响。如果您计划纯化质粒 DNA,请牢记以下注意事项:

  • 插入

    • 如果细菌含有大量插入片段或产生有毒产物的基因,则它们往往会保持较少的质粒拷贝。
  • 大肠杆菌菌株

    • 大多数大肠杆菌菌株可用于繁殖质粒,但 endA- E.coli最适合高产质粒。
  • 生长条件

    • 通气量、温度、培养体积、抗生素和培养基都会影响拷贝数。一些ori对温度敏感;其他ori可以通过添加氯霉素被“欺骗”以放大更多副本- 确保您的生长条件不会对您不利!
  • 培养物

    • 新鲜划线的细菌具有更高的拷贝数—— 为了获得最佳结果,始终选择单个菌落,不要 直接从甘油原液、琼脂培养基或液体培养物中进行继代培养。
    • 与从甘油原液划线的菌落相比,新鲜转化的细胞也能产生更高的质粒产量。
    • 由于细菌刚刚达到稳定期,但细胞尚未开始死亡,因此孵育 12-16 小时往往会产生更高的拷贝数。

参考资料

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