【7.7】质粒准备--纯度和质量要求

并非所有的质粒制备都是相同的。在从细菌培养物中纯化质粒之前,重要的是要考虑您的实验。它将决定您需要的 DNA 数量以及纯度水平。基于这些前提,我们可以用 3 种不同的方式对质粒制剂进行分类:

  • 转化级 DNA Transformation grade DNA
  • 克隆级DNA Cloning grade DNA
  • 转染级 DNA Transfection grade DNA

一、转化级 DNA

转化是在微生物中插入外源DNA的过程。化学感受态细胞和电感受态细胞的细菌转化所需的质粒 DNA 量极少(皮克范围)。它可以从小型细菌培养物(即 2-3 毫升)中提取,无论是否使用市售试剂盒,用于转化的 DNA 不需要像其他用途一样纯净。

图 1:转化将转化级质粒引入细菌细胞。

二、克隆级DNA

分子克隆包括一组用于将来自原核生物或真核生物的重组 DNA 插入到可以具有质粒或病毒来源的合成载体中的技术。该克隆方法的类型选择最终将影响所必需的,因此,也决定了细菌培养和商业套件你将采用提取所需大小DNA的数量。基于限制酶的方法可能需要数百纳克或微克的起始材料;Gibson 组装或金门组装使用更直接的方法,使科学家能够从更少量的 DNA(ng 范围)中进行克隆。

为了实现高效和完美的克隆,重要的是制备物必须不含纯化过程中使用的其他核酸(基因组 DNA 和 RNA)、蛋白质和化学污染物。DNA 纯度的良好指标是 230、260 和 280 nm 处的吸光度测量值。在 260 和 280 nm 处测量的吸光度比应处于 ~1.8 - 2,并为科学家提供纯度与蛋白质污染物的指示。260 和 230 nm 的比率应处于 ~2 - 2.2,并提供纯度与离液剂的指示,如在质粒提取过程中使用的硫氰酸胍和盐酸胍。

图 2:使用克隆级 DNA 将您感兴趣的基因直接克隆到质粒骨架中。

三、转染级 DNA

转染是在哺乳动物细胞中插入外部质粒的过程,每次反应可能需要微克的质粒 DNA。因此,该技术的准备工作必须更大规模,以允许提取足够的质粒以进行多次实验

转染级 DNA 的另一个基本方面是纯度。除了不含任何核酸和化学污染物外,这些 DNA 样本还必须完全不含内毒素。内毒素是革兰氏阴性细菌等的细胞壁的脂多糖。大肠杆菌会影响组织培养细胞系的活力,降低转染效率,并最终影响实验的质量和结果。由于这些原因,市售试剂盒提供了额外的洗涤步骤,以利于去除该试剂以提高转染成功率。

图 3:需要将质粒引入哺乳动物细胞吗?使用转染级 DNA

总之,提前确定如何利用质粒 DNA 对您很重要,这样您就可以决定在数量和纯度方面什么是最佳的质粒制备类型。

参考资料

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