【7.6】优化质粒产量

大多数时候,质粒制备是轻而易举的。您可以从 Addgene 获得刺伤、单菌落连续培养、亚培养,并使用 DNA 制备试剂盒或您实验室最喜欢的内部方案进行制备。此程序的 DNA 产量通常超过 100 ng/ul,这足以通过测序或限制性消化来验证您的质粒。

很有可能,您甚至将剩余的 DNA 用于其他应用,例如PCR、克隆、转染或长期储存。但是对于那些您的质粒产量未达到最佳的讨厌情况呢?如果您的准备工作始终获得次优的质粒产量,请尝试以下我们的提示!

如何优化您的质粒制备

我们将讨论以下提高质粒产量的技术。请记住,您可能需要使用多种技术来进行特别顽固的准备工作。

  1. 检查细菌菌株
  2. 增加体积 Increase the volume
  3. 改善培养传媒 Improve the culture media
  4. 让它孵化 Let it incubate

检查细菌菌株

大肠杆菌宿主菌株之间的差异会影响质粒产量。检查细菌菌株,看看是否需要额外的步骤来优化产量。您可能想要包括额外的洗涤步骤或使用不同的菌株。

1.对于大多数应用,Addgene 使用并推荐DH5 𝝰!

由于其endA1 recA1 relA1基因型,该菌株始终提供良好、高质量的制备,因为这些突变提高了质粒稳定性和产量。

2.如果质粒易于重组

使用针对具有重复元件的质粒优化的菌株,例如具有反向末端重复的病毒质粒。我们使用NEB Stable来转化和制备包含这些元素的高质量 DNA。 在琼脂糖凝胶上制备质粒

3.注意 endA+ 菌株

像Stbl3这样的菌株已经被改造以减少质粒重组,但也是endA+。endA编码一种热稳定的周质内切核酸酶,有时会与您的质粒 DNA 共同纯化并导致您的制备物降解。许多质粒制备试剂盒建议执行额外的洗涤步骤以去除核酸内切酶(示例见右图)。

4.留意碳水化合物 Look out for carbohydrates

某些菌株,包括 HB101 和衍生物,会释放大量碳水化合物,这些碳水化合物可以抑制细胞裂解过程。为确保裂解完成,请使用 Qiagen 的 LyseBlue 等试剂,它使用颜色来显示裂解是否不完全。

5.蛋白表达菌株不利于克隆

适用于蛋白质纯化的细菌菌株利用细胞资源来产生高水平的蛋白质,而不是质粒 DNA。如果您需要从蛋白质表达菌株的质粒中提取大量 DNA,我们建议将质粒重新转化为用于 DNA 纯化的菌株。这听起来像是额外的工作,但从长远来看可能会节省时间!

虽然菌株的选择最终取决于您质粒的特定特征,但建议检查您的大肠杆菌的基因型以确保它适合您的应用。我们之前已经在博客上回顾了许多常见的实验室大肠杆菌菌株,并且还推荐了 OpenWetWare 提供的这个方便的指南,以获得更广泛的常见大肠杆菌菌株列表。

增加体积 Increase the volume

从较大的培养体积开始可以提高质粒产量。 如果我们的质粒 DNA 产量不足,我们的实验室通常会将用于接种的培养物体积加倍。

为什么体积会有所不同?用最简单的术语来说,更多的体积 = 更多的细胞 = 更多的质粒。

质粒的拷贝数可能不同,即培养物中每个细菌细胞内支持的质粒拷贝数。拷贝数部分由质粒的复制起点指定,但也可能受质粒大小、插入物的性质、繁殖菌株、生长条件和用于接种的材料的影响。更复杂的是,质粒拷贝数通常不明确,应该更多地被视为指导方针,因为它们通常基于空质粒骨架的拷贝数或研究人员的个人观察。如果您遇到拷贝数未知的质粒的低产量,则完全有可能您使用的是低拷贝质粒。

当增加培养体积时,请注意,在进行基于过滤器的质粒制备时,通过结合基质的更大体积的裂解物可能会堵塞基质。请务必保持在过滤器的推荐范围内,否则您可能会无意中降低纯化的 DNA 量!此外,如果您已达到裂解物体积限制,则可以通过向培养基中添加氯霉素来增加某些复制起点(例如 p15A、ColE1)的拷贝数。

改善文化传媒 Improve the culture media

更换更丰富的培养基或添加补充剂可以提高细胞密度,从而提高质粒 DNA 产量。培养条件在质粒 DNA 产量中起着关键作用。不同的质粒和菌株的最佳生长条件会有所不同。对于许多高拷贝质粒,标准 LB 肉汤和抗生素浓度就可以了;然而,对于低拷贝质粒或生长较慢的菌株,更换培养基可能是有利的。

1.降低抗生素浓度

低拷贝质粒产生较少的抗生素抗性基因转录本,因此可以在含有通常推荐抗生素浓度一半的培养基中培养。

2.向培养添加补充材料

您可以使用营养丰富的肉汤(如 Terrific Broth、2xYT)或针对质粒产量进行优化的自制肉汤(如 H15)获得更高的细胞密度。在培养基中添加镁盐、缓冲剂等补充剂和/或提供额外的碳源(如甘油或葡萄糖)(适量)也可以提高细胞密度和质粒产量。

3.从单个新鲜菌落开始

直接从冷冻甘油原液或琼脂培养基中进行亚培养可能会导致质粒丢失,而使用旧平板可能会增加质粒丢失或突变。

让它孵化 Let it incubate

增加孵育时间可以提高细胞密度,从而提高质粒产量。您可以优化生长时间、温度和振荡速度,以最大限度地提高细胞密度和质粒产量,因为这些因素通常但不完全相关。

标准生长菌株中高拷贝质粒的典型生长时间为 12-16 小时,但具有较低拷贝质粒的培养物可能需要生长 20 小时或更长时间才能获得最大的质粒产量。 每个质粒/菌株组合的最佳生长时间应根据确定的细胞密度或通过在不同时间点的收获和小量制备来单独确定。测量培养物的光密度可以指示给定体积中存在的细胞数量。

让氧气进来! 确保您的培养物获得适量的氧气以实现最佳生长,因为气体交换不足会阻止您的培养物达到所需的密度。烧瓶或培养管的体积应至少是总培养体积的四倍,并且应确保摇床速度足够快,以便在过夜培养中进行足够的气体交换。通常,烧瓶中的大型培养物可以在 220 RPM 左右摇动,但较小的培养物,尤其是深孔板中的培养物,需要更快的摇动速度以进行适当的通气 (260-300 RPM)。

37℃不适用于每个质粒 某些质粒和菌株在标准 37℃ 以外的温度下生长最好。该质粒特征应在制造商的质粒信息或生长菌株说明中注明。在 Addgene 质粒页面上,您可能会看到保藏者建议在30℃或室温下培养质粒。这些建议通常还需要更长的生长时间。

参考资料

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