【1.1.4】甘油冻存菌、引物、质粒的保存

一、甘油冻存菌的保存与复苏

1.1 简介

按照菌种类型(如DH5α或者表达菌)的不同,分盒保存。冻存盒中的冻存管,可按冻存时间排列。冻存菌保存在-80℃冰箱或液氮罐中。

1.2 材料(MATERIALS)

  • 50%(v/v)灭菌甘油
  • 2 mL 无菌冻存管
  • 1 mL已灭菌的枪头
  • 无菌接种环或灭菌枪头,含有合适抗生素或无抗的LB板

1.3 实验步骤(PROCEDURE)

甘油菌的冻存:

一般保种用的菌液要求浓一些,因此培养时间可以比平时长一些,一般过夜即可; 在无菌操作条件下,分别向已灭菌的2mL冻存管中,加入500uL菌液和500uL 50%甘油溶液,轻轻混匀,务必充分混匀; 甘油冻存菌可以直接保存在-80℃中,有时为了减少菌体因冰晶形成而死亡,也会使用液氮速冻之后在放到-80℃冰箱保存。该冻存菌可在此条件下保存数年之久。随后的冻存和融化操作将会减少保存年限。 (注意:与菌液接触的物品,如枪头、冻存管、50%甘油溶液均需要处于无菌状态,并保证操作在无菌条件下进行。)

甘油菌的复苏:

从甘油冻存菌中复苏细菌,在无菌条件下,打开盖子,使用无菌接种环或灭菌枪头从冻存管中刮取适量冻存菌,划线接种到LB板(含有合适抗生素或无抗)上。操作应适当快一些,以减少冻存管内的融化。 在合适的温度条件下,将划线接种的LB板进行过夜培养。过夜培养后,挑取单个克隆进行后续操作。 (注意:所有东西准备完全后,再去-80℃冰箱取出保种菌,划线动作要快,时间拖得太长会融化冻存菌,而这导致保种菌死亡。)

二、引物保存

2.1 简介

按照用途,引物分为PCR引物,测序引物。而按照存在状态,引物则分为干粉/薄膜状态、100 uM稀释状态、10 uM稀释状态(10 uM为PCR的通常使用浓度)等三种状态。

2.2 材料(MATERIALS)

  • 1.5 mL EP管
  • 无菌蒸馏水

2.3 实验步骤(PROCEDURE)

引物一般有两管(均为干粉状态),其中一管可直接保存,而另外一管可稀释其中引物的浓度至10uM(使用浓度)。两管放置可在同一个冻存盒中的相邻位置,按引物序号排列。

PCR引物则根据引物的浓度不同(一般只有100uM和10uM两种)进行分盒保存。在每一个冻存盒中,按照引物序号依次排列。引物保存在-20℃冰箱中。

引物稀释:

先将装有引物的EP管进行离心,12000g 离心1 分钟,将干粉或薄膜状态的引物离心至管底。然后,根据引物管上指示的体积,加入对应量的无菌蒸馏水,使用枪头吹打混匀,即可得到浓度为100uM的引物。对其进行10倍稀释,即可得到浓度为10uM的引物。

三、质粒保存

3.1 简介

按照用途,质粒一般分为PCR模板型质粒(用于扩增目的基因片段)和蛋白表达型质粒(用于表达目的蛋白)。可按照用途的不同,分盒保存。经常使用的质粒可以保存在-20℃冰箱中,长期保存建议放在-80℃冰箱。

对于新构建的质粒或者购买回来的载体,建议测序正确后再多提几管,放在-80℃冰箱保存。

此外,还可以将质粒转入合适的感受态菌株中,通过保存菌种的方法达到保存质粒的目的。

3.2 质粒中基因组污染是怎样发生的?

基因组污染一般是因为操作过于剧烈发生的,假如为了进步混合作用,选用涡旋振荡的方法来进行混匀,基因组DNA会被剪成小片段,在中和过程中被复性,保留在上清中随质粒DNA一同被回收。所以在质粒提取过程中,动作要尽量温和。

3.3 为什么有些质粒,纯化后长时间放置会降解?

发生这种现象的主要原因是核酸酶污染,除了在制备时简单引进外源核酸酶之外,质粒宿主细胞也会影响抽提质量,JM系列细胞中含有丰富的核酸酶活性,假如制备的质粒需求长时间保存,主张替换宿主细胞,如DH5α、XL1-Blue,用于抽进步质量质粒。

3.4 之前测序没问题的菌液,37℃扩大培育后,质粒的巨细或序列出现异常?

这种情况一般出现在大质粒或较特别的序列中,可能是在大肠杆菌中仿制时发生了重组,能够替换重组酶缺失的菌株,比如JM109、sure菌株,使质粒仿制愈加安稳。

参考资料

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