【4.7.1】蛋白互作技术

目前,研究蛋白质-蛋白质相互作用常用方法主要包括:

  • 酵母双杂交技术 (Yeast Two-hybrid, Y2H)、
  • 双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)、
  • 免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation, CoIP)
  • 荧光共振能量转移技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)
  • 萤火虫荧光素酶互补技术(Firefly luciferase complementation)

上述5种技术中应用最广泛的是Y2H,它可以大规模筛选相互作用的蛋白对,然而,其检测有一定的假阳性率和局限性。Co-IP则需要特定抗体,受如蛋白质提取、结合和洗涤方案等实验操作影响较大,使得每个实验室的结果往往是不同的。FRET分析技术都需要精密的显微镜和计算,在植物上的应用依旧困难重重。与FRET相比,BiFC相对简单,已用于许多植物蛋白质-蛋白质相互作用研究,但由于细胞壁、叶绿体和其他细胞结构产生的自荧光,FRET和BiFC分析在植物中的应用与检测方法变得十分复杂。最后,由外部光源激发荧光引发的干扰,也使其在植物中的应用受限。

因此,采用荧光素酶互补法就具有重要意义。萤火虫荧光素酶的氨基末端和羧基末端只有在融合到两个相互作用的蛋白质上时才能重建活性荧光素酶,可使用植物活体成像系统来进行观测。其技术简便、可靠、灵敏度高、定量,并已获得很多文献的支持,可用于相互作用蛋白的瞬时表达或稳定的转基因表达。

参考资料

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