【5.1】蛋白质标签

蛋白质标签通常是掺入翻译蛋白质中的小肽。如随附的卡通所示,它们具有多种用途,包括(但不限于)纯化、检测、增溶、定位或蛋白酶保护。迄今为止,Plasmids 101 已经涵盖了GFP 及其相关的荧光蛋白,有时用作检测标签;然而,这些只是一类(不可否认的)常见融合蛋白标签。需要过度表达和纯化蛋白质的生物化学家和分子生物学家可能面临许多技术挑战,具体取决于他们感兴趣的蛋白质。经过几十年的努力解决这些挑战,研究人员已经积累了大量的标签和融合蛋白分子工具箱,以帮助重组蛋白的表达和纯化。

稳定性和溶解性标签 Tags for stability and solubility

为了过度表达重组蛋白,需要克服哪些障碍?过表达蛋白质通常不符合细胞的最佳利益。能量和细胞资源被用于制造细胞不需要制造的东西。真核生物和一些细菌利用蛋白体降解细胞可能认为的垃圾蛋白。虽然有许多基于化学和肽的蛋白酶体抑制剂,但谷胱甘肽 S-转移酶 (GST) 可以与重组蛋白融合,用谷胱甘肽进行一步纯化,也可以防止蛋白水解。

这是不稳定的一种形式。原核生物也很难折叠真核蛋白质。你可以让你的细菌产生大量的蛋白质,但如果它没有正确折叠,就没有必要对其进行结晶或测试它的功能。小泛素相关修饰剂 (SUMO) 可以帮助折叠和稳定,麦芽糖结合蛋白 (MBP) 也可以。过度表达也会导致不溶性,聚集的蛋白质不是有用的蛋白质。MBP 标签可以帮助解决溶解性问题,但科学家们也可能会选择添加较小的蛋白质,例如硫氧还蛋白 A (TrxA),可改善二硫键的形成,以帮助保持蛋白质的可溶性。

亲和和纯化标签 Tags for affinity and purification

亲和标签,通常是相对较小的氨基酸序列,基本上是蛋白质的分子链。如果您正在使用未表征的蛋白质,或尚未开发出良好抗体的蛋白质(并且仅仅因为您的蛋白质具有市售抗体,这并不意味着它是好的),那么您迈向的第一步检测、免疫沉淀或纯化该蛋白质可能是将亲和标签与其融合。FLAG、血凝素抗原 (HA) 和 c-myc 标签多年来一直是亲和标签世界的主力,决定使用哪一种取决于您的应用(见下表)。可用于这些标记的抗体确实是好,可用于Western印迹,IP,亲和纯化。

可以说最简单的亲和标签是多组氨酸 (His) 标签。小且不太可能影响功能,His 标记的蛋白质可以使用金属亲和层析进行纯化,通常使用 Ni2+ 柱。与其他亲和标签一样,His 标签可以融合到蛋白质的 N 端或 C 端。与其他表位标签不同—— 当加倍或三倍时,标签大小会迅速增加—— 修改多组氨酸束的长度不会显着改变标签的大小。

组合和分裂标签 Combo and cleavage tags

通常,单个标签是不够的。如果您需要一种标签来增加溶解度和一种标签用于纯化怎么办?或者您想将荧光团与将蛋白质定位到细胞核的标签相结合?或者您想要多轮纯化以使您的蛋白质尽可能纯净?提供不同标签组合的载体很容易获得,尽管向您感兴趣的蛋白质添加太多标签和融合蛋白最终会变得荒谬(您通常不想要比蛋白质更多的标签),但 2-3 个标签越来越普遍。串联亲和纯化 (TAP) 曾经特指由钙调蛋白结合肽 (CBP)、TEV 切割位点(稍后会详细介绍)和 2 个 ProtA IgG 结合域组成的组合标签。 从那以后,TAP 包含了几种其他标签组合,尽管这些组合通常仍包含来自原始 TAP 标签的至少一个元素。还使用术语双标记和双标记( dual-labeling and dual-tagging )。由于其体积小且易于添加到纯化方案中,His 标签经常与其他标签组合以进行双重标记。

所有这些标签的问题在于,它们中的许多都服务于一次性目的,并且您不一定希望它们在服务于该目的后继续存在。在这一点上,蛋白酶可以成为您的朋友而不是您的敌人。两个常见标签(SUMO 和 FLAG)由特定蛋白酶切割,无需添加独立的切割识别位点。事实上,SUMO 不能用于真核生物,因为周围已经有太多的 SUMO 蛋白酶,但是当与纯化的蛋白质一起使用时它很方便,因为酶以与在细胞环境中相同的方式切割 SUMO 标签。FLAG 标签可以被肠激酶切割,肠激酶识别 DDDDK^X,在赖氨酸之后切割。这种切割的效率取决于 X 的身份。

许多其他蛋白酶是可用的,但科学家需要将它们的识别位点合并到他们的蛋白质标签中才能有效地使用它们。最佳优化之一是烟草蚀刻病毒 (TEV) 蛋白酶。TEV 蛋白酶切割位点经常放置在用于两轮纯化的两个标签之间,切割反应发生在柱运行之间。的TEV蛋白酶本身具有各种突变中使用以增加其稳定性的活性,可利用的质粒易于纯化本文中发现(可在Addgene公司)

参考资料

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