【7.4】分析和排除 Sanger 测序结果

当您在凝胶上运行限制性消化(restriction digest )时,您总是包含适当的对照,如未切割的 DNA 和适当的ladder。这些控件可帮助您正确地可视化您的结果。其中最重要的是始终仔细查看从您最喜欢的测序设备返回的测序结果的跟踪文件(或色谱图)。 当涉及到 DNA 测序时,色谱图是您的视觉控制。而且,像所有控件一样,错过是一个大错误。

色谱图可以帮助您分析和排除 DNA 测序结果

上面(这篇文章的右上角)是一个看似干净的 DNA 序列的例子(看不到 Ns)。如果你从未看过痕迹,你会很高兴。

但仔细观察,色谱图中的重叠峰表明结果并不像序列所暗示的那样确定。事实上,这太模糊了,以至于应该重复 DNA 测序反应。

帮助进行 DNA 测序故障排除和分析的指南

1.您可以使用以下任一程序查看您的 .ab1 色谱图文件

  • 4Peaks (Mac)
  • SnapGene Viewer (Mac/PC)
  • FinchTV(Mac/PC)
  • Sequence Scanner (PC)
  • Chromas (PC)

2.您应该看到单个、尖锐且间隔均匀的峰

…像这些…。

3.期望得到500-700个碱基的干净可靠的DNA序列

少一点,您可能会怀疑您的样品受到污染,或者考虑要求您的测序设备对困难的模板应用特殊的协议。再多一点,你就会冒险进入不确定的领域。

4.永远不要相信 DNA 测序读数的前 20-30 个碱基

此处的峰通常无法解析且很小,因此我建议在目标序列上游至少 50bp 处设计引物。

5.使用硅胶离心柱纯化您发送进行 DNA 测序的样品

如果您的测序设施要求您执行自己的 Big Dye PCR 扩增反应(而不是使用某些公司提供的全包服务),您可以通过醋酸钠/异丙醇沉淀法或使用可用的硅胶离心柱纯化产品来自几个供应商。沉淀法有一个不幸的副作用,它会扰乱读数的碱基 70-75 周围的反应(见下图),因此我强烈建议使用硅胶离心柱。它们可能很贵,但非常值得。

6.编辑您的 DNA 序列

最后,当你看到一个误称的峰时,不要害羞。随意编辑它。大多数色谱图查看程序(甚至是免费的)都允许您编辑序列。

我希望这些技巧能帮助您充分利用 DNA 测序结果并解决出现的任何问题。祝您分析序列好运!

参考资料

个人公众号,比较懒,很少更新,可以在上面提问题,如果回复不及时,可发邮件给我: tiehan@sina.cn

Sam avatar
About Sam
专注生物信息 专注转化医学