【2.4】SLIC克隆

如果克隆方法具有个性,那么 SL​​IC(独立于序列和连接的克隆,sequence- and ligation-independent cloning)将是真正的反叛者。该系统不仅不使用位点特异性重组,而且不需要连接步骤!基于在大肠杆菌中发现的强大的同源重组系统,SLIC 是一种廉价、标准化且快速的多部分 DNA 组装方法 - 请继续阅读以了解如何在您的研究中使用它。

起点:不依赖连接的克隆

不依赖连接的克隆 (LIC,Ligation-independent cloning )于 1990 年代首次开发。传统的限制性内切酶克隆使用短的粘性末端,而 LIC 则利用 T4 DNA 聚合酶的外切核酸酶活性来产生更长的、约 10-12 个碱基的“回切”突出端。反应混合物中仅存在一种类型的 dNTP,将核酸外切酶活性限制在该核苷酸的第一次出现。在那个位置,T4 将执行有利的聚合酶反应,随后由于其他 dNTP 的缺失而停止。一旦分别消化,载体和插入片段就可以退火,形成一个带有四个切口的圆形产物,转化后很容易被细菌修复。

LIC 是一种可靠的克隆方法,但受到其序列约束的限制。10-12 碱基突出端不得包含反应中存在的 dNTP,否则会在该位置发生聚合,从而防止 T4 咀嚼整个 10-12 碱基。因此,LIC 的使用通常仅限于专门设计的质粒。

独立于序列和连接的克隆:SLIC 改造 Sequence- and ligation-independent cloning: A SLIC makeover

2007 年,LIC 收到了重要更新,由 Addgene 存款人Stephen Elledge 提供。他的新方法称为独立于序列和连接的克隆 (SLIC),消除了 LIC 的许多限制。SLIC 的关键是同源重组的力量。在大肠杆菌中,强大的同源重组系统允许基于序列同源性区域修复缺口和突出端。这个过程可以通过以下两种途径之一发生:RecA 介导的重组或 RecA 独立的单链退火。Elledge 意识到他可以通过 PCR 和不精确的 T4 核酸外切酶活性产生不完美的“重组中间体”,从而克服 LIC 中对精心设计的 DNA 悬垂的要求。只要有足够的序列同源性 (20-60 bp) 来组织片段并将它们固定在一起,大肠杆菌将能够“修复”质粒,产生重组DNA。在转化前孵育中加入纯化的 RecA 可增强修复过程,允许 SLIC 用于极少量的 DNA(例如 3 ng)。当处理大量 DNA (~100 ng) 时,不需要 RecA。

成为 SLIC 的实用性

要开始 SLIC 克隆过程(见上图),需要对感兴趣的片段进行 PCR 扩增以添加指定的 5’ 和 3’ 同源区域。该 PCR 片段和线性化质粒均在不存在 dNTP 的情况下使用 T4 聚合酶进行部分消化。在第二步中,添加单个 dNTP 会停止核酸外切酶反应。然后将 PCR 片段和质粒结合、退火并转化到大肠杆菌中. 更简单的是,SLIC 还兼容不完全合成或 iPCR 的片段(上图的右侧分支)。如果 PCR 不包括最后的延伸步骤,由于延伸不完全,许多产物将具有单链突出端,这些片段会诱导重组。上图中间分支所示的混合 PCR 也可用于创建插入片段。两个 PCR 产物用于生成具有 5’ 或 3’ 突出端的目标基因。当产品混合并退火时,25% 的所得 DNA 将具有两条单链突出端,可以有力地刺激重组。

SLIC 非常适合多组分组装(见下图),因为重叠序列同源性指定了多个片段的顺序,并且组装是无痕的。对于 40 bp 同源区域,五片式组装反应非常高效 (~80%)。十片段组装也可以成功,但效率较低 (~20%)。

SLIC 与其他克隆方法相比如何?

SLIC 的局限性源于它对单链悬垂的依赖。这些悬垂必须可访问以允许互补碱基配对,因此如果悬垂具有稳定的 ssDNA 二级结构,则不能使用 SLIC。一个常见的例子是转录终止子的茎环结构。另一个潜在问题是序列相似性。如果多组分组装中的片段彼此具有 5’ 或 3’ 序列同源性,则它们可能组装不正确。为了克服这一限制,一种选择是执行分层组装,分多个步骤组装片段,以避免在同一反应中使用多个共享同源性的片段。在这些情况下,使用另一种克隆方法,例如金门组装,也可能是有益的。

SLIC 最常与Gibson 组装相比较,Gibson 组装是另一种基于同源重组的克隆方法,将在即将发布的 Plasmids 101 文章中进一步详述。Gibson 组装不使用 T4 DNA 聚合酶,而是需要 T5 核酸外切酶与 Phusion 聚合酶和 DNA 连接酶结合使用。该反应一步发生,而不是 SLIC 所需的两步,连接酶可以提高多部分组装的效率。Gibson 组装发生时的较高温度也可能限制片段末端二级结构的形成。SLIC 相对于 Gibson 组装的主要优势是成本,因为 T4 聚合酶比 Gibson 组装所需的酶便宜得多。

SLIC 是一种用于多片段 DNA 组装的标准化方法,其低成本使其成为进行大量克隆的研究人员的理想选择。与 Gateway 克隆不同,组装是无疤痕的,并且该方法的灵活性使其能够与不同类型的 PCR 生成的插入物一起使用。通过利用大肠杆菌中 DNA 修复的力量,您可以组装多个片段,而无需特定的限制性位点或 DNA 连接酶!

参考资料

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