【2.1.2】TA克隆

分子克隆 : 是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。利用酶学原理,在体外将不同来源的片段与载体通过酶切,连接的操作重组成一个杂合分子,再通过转化与转导的方式,引入到合适的宿主细胞中进行复制和扩增。

  • TA克隆:PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性,通常在3’加上A。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片段才能通过T/A配对进行连接(即T载体),将二者连接,即TA克隆。
  • HindⅢ:识别位点是:AAGCTT,割后的片段具有黏性末端。
  • 平末端:是平的,连接效率只有黏性末端连接效率的1%。
  • 黏性末端:切口不是平的。

传统的构建重组质粒的方法为TA克隆。该方法需要将构建进载体的片段通过PCR技术引入合适的酶切位点扩增出来,随后与T载体进行连接。将连接好的质粒转化大肠杆菌进行扩增,随后对扩增好的质粒进行酶切,得到含有粘性末端的片段。将该片段与同样经过双酶切的载体进行连接,转化大肠杆菌后即可得到重组质粒。

图一 TA克隆流程图

然而传统的TA克隆存在诸多缺点,比如实验周期较长、受片段上的酶切位点影响等等。

酶切法为什么要进行TA克隆呢?

  1. 由于酶切效率和连接效率低等原因使得载体构建相当困难
  2. 由于PCR扩增目的基因是体外扩增,很容易发生突变
  3. TA克隆有着成功率高的优点,通过TA克隆将目的基因构建进pMD19T等T载体进而转化入大肠杆菌中。
  4. 单克隆菌体自身的修复机制可保证单一的克隆,利于筛选需要的序列,通过后续测序鉴定可以得到大量正确的目的基因片段,而且直接将PCR产物切下来不易产生粘性末端,连接入表达载体比较困难,通过TA克隆酶切的目的片段产生粘性末端的概率很高。

参考资料

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