【1.5.1】终止子和 PolyA 信号

设计用于在给定宿主细胞类型中表达基因的质粒通常根据它们包含的功能元件分为两大类,原核或真核。原核和真核系统中的质粒 DNA 都必须转录成 RNA,它发生在三个阶段:起始、延伸和终止。在上一篇文章中,我们讨论了启动子在基因转录起始步骤中的作用;今天我们将概述转录如何停止或终止

什么是终止和聚腺苷酸化?(termination and polyadenylation)

终止子是一种基于序列的元件,其作用是定义转录单位(例如基因)的末端,并启动从转录机制中释放新合成 RNA 的过程。终止子位于待转录基因的下游,通常直接出现在任何 3’ 调控元件之后,例如聚腺苷酸化或 poly(A) 信号。虽然许多研究都将启动子强度作为基因表达水平的决定因素,但终止子在 RNA 加工中也起着重要作用,并有助于 RNA 半衰期的可变性,最终导致基因表达。

聚腺苷酸化是将多个腺嘌呤 (A) 核苷酸转录后添加到信使 RNA 转录物的尾部。聚腺苷酸化的目的和机制因细胞类型而异,但聚腺苷酸化通常用于促进真核生物中的转录本寿命并促进原核生物中的转录本降解。

原核终止

原核终止机制分为两大类:rho 依赖性和 rho 独立。Rho 因子是一种解旋酶,可协助 RNA 聚合酶终止转录。在基于质粒的表达系统中通常不使用依赖于 Rho 的终止子,因此这里不会详细介绍,但最后提供了其他参考资料。

几乎所有常见的细菌表达质粒都使用独立于 Rho 的终止子,其中包括天然存在的终止子,如 T7 和 rrnB,以及工程化的高效终止子,如 T0。Rho 独立终止也称为内在终止,它依赖于在 RNA 转录物中形成富含 GC 的发夹,然后是弱结合的聚尿嘧啶束,如右图所示。发夹-DNA 复合物的三级结构被认为会破坏转录复合物的稳定性,启动转录物的裂解。

没有终止子能 100% 有效地停止模板转录和启动所需的切割事件,尽管一些工程终止子接近 (>95%)。然而,对于大多数目的,任何常见的终止符就足够了。许多商业表达载体使用双终止子来减少下游元件的不需要的翻译。 高亲和力终止子可能是期望的用于多顺反子构建体(multi-cistronic constructs),其中高终止效率是必要的,以尽量减少转录通读(transcriptional read-through)。Chris Voigt 的实验室对一组原核终止子进行了表征,并将其中的几个保存在 Addgene (1) 中。

原核聚腺苷酸化 Prokaryotic polyadenylation

尽管大多数人认为是真核生物特异性过程,但原核生物也会向某些 RNA 添加 poly(A) 尾巴。与需要共有序列来添加 poly(A) 尾的真核机制不同,在原核转录本上添加 poly(A) 尾是非特异性的,可以添加到任何可访问的 3’ 末端。poly(A) 尾部的存在将 RNA 靶向降解体,降解体包含切割不受二级结构保护的 RNA 的酶。据认为,poly(A)s 用于控制调节性 RNA 的细胞浓度,并且还可以作为一种质量控制机制来清除细胞中错误折叠的 RNA。

真核终止和聚腺苷酸化 Eukaryotic termination and polyadenylation

与具有单一 RNA 聚合酶进行转录的原核生物不同,真核生物具有三种 RNA 聚合酶(聚合酶 I、II 和 III),每种酶负责转录不同类型的 RNA:

  • 聚合酶 I 负责核糖体 RNA,
  • 聚合酶 II 负责 mRNA 和miRNA
  • 聚合酶 III 转录 tRNA 和其他短 RNA。

尽管不像原核生物终止那样深入研究,但了解真核生物终止的基本过程,并且已经注意到每种真核生物 RNA 聚合酶的终止方式不同。例如,聚合酶 III 依赖于特定序列和 RNA 二级结构来诱导转录物切割,类似于原核生物中发现的不依赖 Rho 的终止。这与聚合酶 I 和 II 不同,聚合酶 I 和 II 都需要结合终止因子。尽管两者都依赖于终止因子,但聚合酶 I 和 II 采用不同的机制来终止转录。聚合酶 I 使用类似于原核 Rho 依赖性机制的过程,而聚合酶 II 终止更复杂,涉及两种 RNA 聚合酶相关蛋白,CPSF 和 CstF,它们负责招募裂解酶和聚腺苷酸化酶,这一过程似乎将终止与多聚腺苷酸结合起来。

哺乳动物表达质粒主要用于产生 mRNA,常用的哺乳动物终止子(SV40、hGH、BGH 和 rbGlob)包括序列基序 AAUAAA,它促进多聚腺苷酸化和终止。在列出的那些中,由于存在额外的辅助序列 (2-3),SV40 晚期 polyA 和 rbGlob polyA 被认为在终止转录方面更有效。

如上所述,聚合酶 II 转录物(以及 mRNA)的终止和多聚腺苷酸化是协调过程。共有基序和下游富含 GU 的区域(如下图所示)之间的切割从聚合酶中释放出 mRNA,并产生一个游离的 3’ 末端,现在可用于聚腺苷酸化。添加 poly(A) 尾部对于 mRNA 的稳定性、防止降解很重要,并且也是核输出和翻译过程不可或缺的一部分。

使用哺乳动物 poly(A) 信号与某些病毒包装系统相结合会降低病毒滴度,但可以提高转录本寿命,因此应谨慎处理 (4) 。出于这个原因,病毒载体通常使用其他非聚 (A) 转录物稳定和核输出元件,例如 WPRE (5) 和 CTE (6) ,和/或使用较弱的聚 (A) 信号,例如 BGH。

参考资料

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