【7.2】验证您的质粒

恭喜,您有一个表达您感兴趣的基因 (YGOI) 的质粒,并准备好深入您的功能实验!无论您是自己克隆质粒还是从大厅的同事那里获得它,花一些时间来确认您正在使用正确的构建体,并验证您收到的质粒是否与预期的序列匹配总是一个好主意. 在 Addgene,我们使用基于 NGS 的质量控制来确认我们分发的所有质粒的序列。这种方法需要大量时间,因此我们推荐多种方法来筛选和验证您的质粒。

测序

测序确定 DNA 分子(在这种情况下是质粒)内核苷酸的精确顺序。 首先,您需要设计和合成与您的质粒序列完美互补的引物。 我们建议从骨架特异性引物开始,该引物将在多克隆位点 (MCS) 上测序并进入 YGOI。 这样您就可以避免设计多个引物来验证插入同一主链的独特基因。 Addgene 策划了一个全面的载体数据库,可帮助您找到许多常用骨架的参考序列,以及用于确认其完整性的特定引物。 您还可以在此处找到我们最常用的测序引物列表。 将您的样本提交给测序核心后,通常需要几天时间才能收到结果(取决于您所在机构提供的核心设施和服务); 然而,从长远来看,知道您正在使用正确的质粒,它将为您节省时间。

诊断限制摘要 Diagnostic restriction digest

诊断消化(Diagnostic digests)可用于根据质粒内不同特征 的预测大小和组织来确认质粒的粗略结构。即使您没有完整的质粒序列,也可以成功使用限制性分析。纯化质粒 DNA 后,该方法可以在不到一天的时间内在您的实验室中完成。诊断性限制性消化由 2 个独立的步骤组成:1) 将您的 DNA 与在特定位点切割 DNA 分子的限制性内切酶一起孵育;2) 在琼脂糖凝胶上进行反应以确定所得 DNA 片段的相对大小。

限制性消化通常用于通过从骨架上切除插入片段来确认特定载体中插入片段的存在。为此,您将使用带有位于插入片段两侧的限制性位点的酶。您将需要知道载体主干的大致大小以及插入的预测大小。如有必要,您可以在NCBI中搜索YGOI 以查找特定的参考序列。

带有质粒图谱的限制性消化凝胶右侧的示例质粒总大小为 7.3kb,包括 1.2kb 的插入片段。质粒用 2 种独特的酶(HindIII 和 BamHI)消化 并在琼脂糖凝胶上运行。得到的凝胶图像包括一个 1kb 阶梯(泳道 1),其条带范围从大约 500bp 到 10kb,其中 3.0kb 片段的强度增加以用作参考条带。未切割的 DNA(第 2 道)显示了 3 种可能的质粒构象,松弛和切口用星号 (*) 标记。当质粒单独用HindIII 和 BamHI消化 时 (泳道 4-5),有一条 7.3 kb 的单条带代表质粒的全长。HindIII 和 BamHI 的双重消化(第 3 道)在 6kb 和 1.2kb(红色框)处产生条带,分别匹配主干和插入片段。凝胶上的结果对应于预测的大小。

限制摘要提示和技巧: Restriction digest tips and tricks:

以下提示将使您更容易获得有用且信息丰富的诊断限制摘要。

对于您的摘要:For your digest:

  • 尝试选择独特的酶。仅切割一次的酶使您可以更轻松、更准确地可视化构建体的完整尺寸。

  • 用一种以上的酶消化时,请考虑缓冲液和温度的兼容性。有关每种酶的最佳工作条件,请参阅制造商手册 。

  • 注意甲基化问题。XbaI 和 ClaI 等酶对甲基化敏感,它们的活性可能会被阻断。如果您必须使用这些酶进行消化,您将需要从 dcm 或 dam 甲基化缺陷细菌菌株(如 JM110 或 INV110)中纯化您的 DNA。

  • 避免明星活动。一些核酸内切酶(例如 BamHI)能够切割与其定义的识别序列相似但不相同的序列。大多数酶制造商生产内切核酸酶的高保真版本和/或提供定制缓冲液作为避免此问题的手段。

对于您的凝胶:

  • 在倒入凝胶之前,将溴化乙锭 (EtBr) 添加到凝胶中。EtBr 与 DNA 结合,使您可以在紫外 (UV) 光下观察 DNA。

  • 在加载之前不要忘记在消化反应中添加加载缓冲液。缓冲液中的甘油将确保您的样品很好地沉淀在凝胶中,而染料提供了一个视觉参考点,因此您可以轻松地评估凝胶运行的程度。额外奖励:染料也会以预测的尺寸运行,因此您可以根据染料 估计您的条带在凝胶中移动了多远!

  • 总是跑梯子(Always run a ladder)。梯形图允许您解释您在样品泳道中获得的条带。根据预期的乐队大小选择您的梯子。

  • 始终运行对照未切割的 DNA,以确保您的酶正常工作。当分离未切割的质粒 DNA 并在琼脂糖凝胶上运行时,您可能会看到 3 个条带。这是因为环状 DNA 具有几种最丰富的构象:超螺旋、松弛和切口(supercoiled, relaxed and nicked)。如果您的摘要通道看起来像您未切割的通道,那么一定有问题!

  • 量化您的 DNA。加载过多的 DNA 会使获得清晰的条带和分析结果变得困难。额外好处:知道您在每个孔中加载了多少 DNA 将使您能够 估计类似大小的强度相当的样品的 DNA 质量。

  • 在 80-150V 下运行凝胶,直到条带之间有良好的分离。当溴酚蓝染料线在凝胶下方大约 75-80% 时停止凝胶将确保您防止较小的条带流失;但是,您可能需要将凝胶运行更长时间才能实现较大 DNA 片段的良好分离。

参考资料

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