【5.2】轻松标记您最喜欢的酵母基因

同源重组是几乎所有生命领域修复基因组损伤的过程,特别是双链断裂。长期以来,研究人员一直利用这一自然过程将蛋白质标签整合到酿酒酵母 和 粟酒的基因组中 。该方案出奇地简单,只需要一个 PCR 产物,其中包含修饰序列,两侧是与染色体插入位点同源的大约 50 个碱基对的序列。通过直接转化将线性 PCR 产物引入细胞。给定的插入片段通常包含蛋白质修饰序列和用于分离成功转化体的可选择基因产物。

Addgene 分发多种即用型模块化质粒,结合了荧光标签、表位标签、蛋白酶位点和选择标记。这些在需要标记多种蛋白质产品的蛋白质复合物研究中特别有用,因为多个选择标记可以确保所有所需的标签都已整合。只需设计具有所需靶向同源性的扩增引物(当然是在框架内)并开始标记!

用于成像的酵母优化荧光团

Lee S, et al. (2013) PLoS ONE 8(7): e67902.

许多成像研究依赖于荧光蛋白(FP) 与感兴趣的酵母基因的直接融合。这些荧光标记的基因在天然条件下表达,使科学家不仅可以跟踪单个蛋白质的丰度、运动和定位,还可以通过 FRET 研究蛋白质-蛋白质相互作用。UCSF 的 Sidae Lee、Wendell Lim和Kurt Thorn最近开发了一系列蓝色、绿色和红色 FP,这些 FP 是专门为在酵母中表达而进行密码子优化的。这些标记载体基于先前描述的 pFA6a 链接载体,包括 Kan、SpHIS5 或 CaURA3 选择标记。 Lee 等人 (1) 评估了酿酒酵母中的许多荧光标签,查看它们在诸如亮度、稳定性和标记蛋白质破坏等类别中的表现。根据他们的发现,作者推荐了用于酵母成像的最佳 FP 组合,按特定过滤器组和实验输出要求进行分类。从这些酵母优化的荧光标记载体中 进行选择, 用于您的单色或多色成像实验。

对表位标签感兴趣?

其他人可能有兴趣将表位标签附加到他们感兴趣的基因上,以便轻松捕获和检测蛋白质和复合物,而不会出现有时与基于质粒的过度表达相关的伪影。 犹他大学的Tim Formosa构建了完整的酵母标记模块集合蛋白酶位点(TEV 或 PreScission)、表位标签(12xHis、2xStrep、3xFlag、Protein A 或 V5)和选择标记(KanMX、HphMX 或 His3MX)的每种可能组合。该集合中的每个 PCR 产物都会产生一个插入片段,其格式为(蛋白酶位点)-6xGly 接头-(表位标签)-ADH1 终止子-(选择标记)。此外,Formosa 博士还保藏了六个带有多克隆位点的质粒,以代替表位标签,用于创建您自己独特的蛋白质融合。该系列是蛋白质复合物串联亲和纯化的理想选择。

John Pringle和Jürg Bähler存放了大量质粒,用于在酵母中进行基因组修饰,由 Pringle 博士在 UNC 教堂山的前实验室开发。 Bähler 等人 (2) 描述了用于S. Pombe 中各种基因组修饰的模块化质粒集合,包括完全和部分基因缺失、过度表达(通过启动子替换)以及在 N 或 C 末端标记(3xHA、13xMyc、GST 或 GFP)。 Longtine 等人 (3) 描述了一组用于酿酒酵母的免费质粒,具有多个选择标记的额外好处,用于在单个菌株内组合修饰。

除了上述精选系列之外,Anne Robinson、Eishi Noguchi和Melissa Moore的实验室还开发了许多其他模块化酵母标记系统,仅举几例。

参考资料

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