【3.1.2】酵母载体

为什么科学家使用酵母载体?

酵母是真核生物,因此 包含类似于植物和动物的复杂内部细胞结构。与细菌不同,酵母可以对蛋白质进行翻译后修饰, 但它们仍然具有许多与原核生物相同的技术优势。这包括但不限于: 快速生长、易于复制铺板和突变体分离、定义明确的遗传系统和高度通用的 DNA 转化系统。与大多数其他微生物不同,酵母具有稳定的单倍体和二倍体状态,可用于遗传分析,以及有效的同源重组机制,以促进简单的基因替换/突变。

实验室中使用的酵母表达质粒通常包含所有必需的成分,以允许在大肠杆菌 和酵母细胞之间穿梭 。为了在实验室中有用, 除了细菌 ORI 和抗生素选择标记之外,载体还必须包含酵母特异性复制起点 (ORI) 和酵母细胞中的选择方法。

复制的酵母源 The yeast origin of replication

(请注意:第一部分主要与芽殖酵母酿酒酵母中的ORI 相关;但是,我们还注意到了裂殖酵母、粟酒裂殖酵母、最后的 载体复制所需的一些特征 。)

在前一篇文章中,我们简要讨论了细菌 ORI 的调节如何决定细菌细胞内的质粒拷贝数。类似地,酵母载体中包含的特定 ORI 元件决定了质粒如何在酵母细胞内复制和维持。这些元件不仅控制在每个细胞中发现的质粒数量,还控制质粒是整合到宿主 DNA 中还是作为附加体独立复制。四种主要类型的酵母质粒定义如下:

  • 酵母整合质粒 (YIp,Yeast Integrating plasmids):这些质粒缺乏 ORI,必须通过同源重组直接整合到宿主染色体中。

  • 酵母复制质粒 (YRp,Yeast Replicating plasmids): 这些载体包含源自酵母染色体的自主复制序列 (ARS)。 顾名思义,这些载体可以独立于酵母染色体进行复制;然而,它们往往不稳定,可能会在萌芽期间丢失。

  • 酵母着丝粒质粒 (YCp,Yeast Centromere plasmids):这些被认为是低拷贝载体,并结合了 ARS 的一部分以及着丝粒序列 (CEN) 的一部分。这些载体复制就好像它们是小的独立染色体一样,因此通常作为单个拷贝被发现。与 ARS 载体不同,CEN 载体在没有整合的情况下是稳定的。

  • 酵母附加型质粒 (YEp,Yeast Episomal plasmids):它们与细菌质粒最相似,被认为是“高拷贝”。来自 2 微米环(天然酵母质粒)的片段允许 50+ 拷贝稳定繁殖每个细胞。如果包含特定的可调节元素,也可以控制这些载体的拷贝数(在此处查看)。

另一方面,用于S. pombe 的质粒不需要明确定义的 ORI。相反,DNA 的大小和 AT 含量(显然独立于已知的特定序列)决定了这些载体的复制。S. pombe质粒通常利用 ARS 来帮助实现高转化效率;然而,该区域并不一定会促进复制。

酵母选择标记

从历史上看,由于自发产生抗性突变体的比率很高以及 酵母菌株对某些抗生素不敏感,科学家在研究酵母时使用了营养缺陷型选择而不是抗生素选择。营养缺陷被定义为生物体无法合成其生长所需的特定有机化合物。存在许多营养缺陷型酵母菌株,当它们在含有缺失营养物质的培养基上生长时很容易维持。科学家可以通过包含补充宿主营养缺陷的功能基因的副本来利用这些宿主突变。当在不含营养物的培养基上生长时,宿主细胞将死亡,除非它们掺入了携带所需基因的质粒。

下表列出了酵母中一些最常用的选择标记,并提供了克服营养缺陷型所需的元素以及所述元素的其他用途。此链接提供了更广泛的酵母营养缺陷标记列表,并包括相关参考文献。

使用营养缺陷型选择时的注意事项

当然,使用营养缺陷型标记作为选择手段有一些缺点:

  1. 需要对缺乏该化合物的酵母菌株使用特定的选择标记。因此,必须使用已知的营养缺陷型菌株/选择元件对,或者需要在实验之前创建新的组合。

  2. 由于高拷贝数,由质粒提供的标记可能以高于正常生理水平的水平表达。这对酵母细胞造成潜在的代谢负担。

  3. 由于存在非生理水平的选择标记,某些表型可能会发生改变。

科学家们尝试了多种方法来解决这些问题。减少标记基因表达量的一种方法是使用部分缺陷的启动子来驱动选择标记的表达。这减少了细胞中存在的基因产物的量,从而使酵母能够保持更高的拷贝数。此外,抗生素选择的改进使得在酵母中利用更传统的药物选择方法作为使用营养缺陷型标记物的补充或替代方法变得可行。在MX系列抗生素抗性盒的 最常用的是,与KanMX为最普遍的,因为它versility和能力在细菌,酵母和哺乳动物细胞中使用。

参考资料

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