【5.2.3.4】亲和层析

亲和层析主要依靠蛋白质与介质配体间特异性的可逆结合作用进行分离。配体可直接与目标蛋白质结合,也可以与蛋白质共价结合的标签结合。亲和层析通常是一种最粗放的纯化过程,一般在纯化工艺的前期应用。基于后续应用的要求,可能只需要一步亲和层析即可获得纯度合格的蛋白质。

亲和层析的固定相是一种共价结合特异性配体的惰性介质,该配体可与一个蛋白质或一类蛋白质特异性结合。惰性介质通常是交联的琼脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白质可采用选择性或非选择性模式来进行亲和柱层析纯化。在选择性亲和柱层析中,一般使用对蛋白质有特异性作用的配体或共价结合的标签。在非选择性亲和柱层析中,如用于免疫球蛋白纯化的蛋白A、G、L,用于DNA结合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等,这些配体与一类蛋白都具有相似的结合能力。

图 4. 用蛋白A、G、L进行亲和层析的原理示意图:A.抗体含有多个功能区:一类蛋白质的Fc区(片段,恒定区) 都是相同的,Fv区(片段,可变区)是每个抗体各不相同的特异区,Fab(片段,抗原区)是抗体实际与特异性抗原结合的区域。B.抗体的特异性区域可以通过亲和色谱进行非选择性纯化,在该过程中,配体 (蛋白 A、G、L)是结合在分离介质上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于纯化特异性蛋白。这种情况下,抗体作为中间配体为其抗原提供选择性。

两类亲和色谱中,在不影响蛋白质(或标签) 和配体间作用力的条件下,蛋白质均在柱上保留。在不破坏特异性相互作用但可破坏所有杂蛋白与固定相间其非特异性作用的条件下,对所有结合的蛋白质进行淋洗。最后用含有竞争分子的缓冲液或者可破坏所有蛋白质间相互作用的条件对结合蛋白进行洗脱。

竞争分子可代替目标蛋白与配体相结合。这种竞争分子可通过其他层析手段或者透析的方式从目标蛋白中去除。通过破坏所有蛋白间相互作用来从固定相洗脱蛋白的方法包括调节缓冲液的pH值或者离子强度。因为这些方法同样会影响蛋白质的稳定性,因此通常建议洗脱下来的蛋白质要立即中和或者稀释以将危害降到最小。有报道称,对于不同形式的亲和层析,为获得最高产率的活性蛋白需采用多种不同的流动相条件 。

总结自Thermo Fisher Pierce和GE。不同类型层析柱的供应商见下,由来邦网(Labome)基于200余篇文献调研给出。

设计蛋白质表达质粒时,即可在其N端或C端(或在少数情况下,在结构已知蛋白质的柔性环状区域) 引入亲和标签以助于纯化。

抗体通常是基于抗体与其抗原 (抗体识别的序列) 间的高特异性相互作用来进行纯化。一个含有抗原的多肽可以与带有抗体特异结合位点的介质相结合。降低流动相缓冲液的pH值可破坏抗体/多肽间相互作用力,释放出结合抗体。商业上,该方法常用于血清原液中抗体的纯化。

蛋白质同样可通过非选择性方式进行亲和纯化。在非选择性纯化过程中,固定相上结合的配体可以与一类具有类似结合部位的蛋白质相结合。DNA结合蛋白质的纯化就是一个非选择性亲和层析的实例。因为肝素与DNA的结构和电荷极为类似,它可以被作为DNA结合蛋白质亲和层析的配体。

由于所有的DNA结合蛋白质理论上都可以与该固定相结合,几乎其他所有蛋白质都会穿透而不与介质结合,从而可达到目标蛋白产率最大程度的富集。另一个例子是抗体通过其恒定区 (Fc)与配体间的相互作用进行富集浓缩,蛋白A、G、L都是常用的配体。GE Healthcare的蛋白A亲和层析柱 [15-17] 和蛋白G [18] 都是常用的选择。

当采用类似的结合模式(抗体与蛋白A、 G或 L配体结合)时,抗体的抗原结合区(Fab)仍然保持与其特异性抗原结合的能力。因此,特异性蛋白可通过配体/抗体结合和抗体的抗原间的特异性相互作用来纯化。

参考

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