【6.8.4.1】重组DNA技术中常用的工具酶

在重组DNA技术中,常需要一些基本工具酶进行基因操作。例如,对目的基因进行处理时,须利用序列特异性的限制性核酸内切酶在准确的位置切割DNA,使较大的分子成为一定大小的DNA片段。构建重组DNA分子时,必须在DNA连接酶的作用下,才能使目的基因片段与载体连接。此外,还有一些工具酶也是重组DNA时必不可少的。先将某些常用工具酶概括于下表:

  • 限制性核酸内切酶: 识别DNA特定序列,切断DNA链

  • 耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶): 聚合酶链反应(PCR)

  • DNA连接酶:连接两个DNA分子或片段

  • 多核苷酸激酶 : 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化,制备末端标记探针

  • 末端转移酶 : 在3’末端加入同聚尾

  • 碱性磷酸酶: 切除核酸末端磷酸基

  • S1核酸酶、绿豆核酸酶: 降解单链DNA或RNA,使双链DNA突出端变为平端

  • DNA酶Ⅰ :降解DNA,在双链DNA上产生随机切口

RNA酶A : 降解除去RNA

反转录酶: 催化以单链RNA为模板生成DNA反应的酶,称反转录酶。

  1. 合成cDNA
  2. 替代DNA聚合酶I进行填补、标记或DNA序列分析

DNA聚合酶I或其大片段(Klenow)

  1. 缺口平移制作标记DNA探针
  2. 合成cDNA的第二链
  3. 填补双链DNA的3’凹端
  4. DNA序列分析

下面,我们重点介绍再基因重组中最重要的限制性核酸内切酶和DNA连接酶。

一、限制性核酸内切酶

(一)、核酸酶概念与分类:

核酸酶分为两类:

  • 核酸外切酶(exonuclease)是从核酸的一端开始,一个接一个把核苷酸水解下来;
  • 核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3'-5’磷酸二酯键,将核酸链切断。

很多细菌和细胞都能识别外来的核酸并将其分解,1962年发现这是由于细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特异的核酸序列而将核酸切断;同时在细菌体内还伴有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶(methlase),能使细胞自身核酸特定序列上的碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解。这样细胞就构成了限制-修饰体系(restriction modification system),其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,以保护和维护自身遗传信息的稳定,这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性内切酶中“限制”二字概念的由来。

(二)、限制性核酸内切酶的概念与分类

限制性核酸内切酶是一类专门切割DNA的酶,它们能特异的结合一段被称为是限制性内切酶识别序列的DNA序列,并切割双链DNA。

限制性核酸内切酶可分为3种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖ATP的限制(切割)活性。

Ⅲ型限制酶在识别位点上切割DNA,然后从底物上解离。

Ⅰ型限制酶的切割位点与识别位点不一致,它结合与识别位点,但却随机的切割回转到被结合酶处的DNA,在分子克隆中,Ⅰ型和Ⅲ型限制酶都不常用。

Ⅱ型限制-修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统:一种为限制酶,它识别和切割某一特异性的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。迄今人们已分离出大量的Ⅱ型限制酶,其中许多已应用于分子克隆中。这一节我们主要介绍Ⅱ型限制酶。每一种Ⅱ型限制酶的识别序列都有其特定的核苷酸序列,因此只要知道DNA的序列,就可以找出限制酶的识别位点,并可计算出酶切后DNA片段的长度(以核苷酸对或碱基对的数目表示)。

(三)、限制性内切酶的作用特点

1.限制酶识别位点

(1)一般特征:Ⅱ型限制酶所识别的特殊的DNA序列亦称为限制酶识别位点或酶切位点,一般长度为4个、5个或6个核苷酸对,且成二重对称结构。

有少数限制酶识别更长的序列或简并序列。

(2)简并序列:简并序列是指序列中有的核苷酸位点可以是不同的核苷酸。如,GTYRAC(HindⅡ),其中Y=C或T,R=G或A,YR可以是CG、CA、TG或TA。所以HindⅡ实际上可识别4个特定的序列。

(3)与切割位点不同的识别位点:有些限制酶的切割位点是在识别位点的附近。如,Hgal的识别位点是GACGC(5/10),在两条DNA链上切割位点分别距识别位点5个和10个核苷酸。

2.限制酶的切割位点

限制酶在识别位点切割DNA时,其具体的切割位点(磷酸二酯键断开的位点)相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶刚好在对称轴处同时切断DNA的两条链,产生带平头末端的DNA片段;另一些酶则在对称轴两侧类似的位置分别切断两条链,产生带有单链突出的粘性末端的DNA片段。有6个核苷酸对组成的限制酶识别位点,不同的酶对各自位点切割时可以产生5种不同的断裂方式。

点击后看大图 3.同裂酶(isoschizomer)

通常,不同的限制酶有不同的识别序列,然而有许多不同来源的限制酶切割DNA后产生相同的末端,这些酶就是同裂酶。同裂酶有3种类型。

(1)同功异源:不同来源的限制酶可以切割同一靶序列。如MboI和Sau3AⅠ均可以切割以下靶序列:

(2)一个位点包含在另一个位点之中:一些酶识别4核苷酸序列,这种核苷酸序列包含在另一些酶的6核苷酸识别序列中。例如MboⅠ和Sau3AⅠ位点与BamHⅠ位点即具有这种特点。

(3)两位点切割后的断裂末端相同:有些酶识别的完整序列不完全一样,但切割位点间的序列一样。如:

末端相同,可交叉连接,这在DNA重组时是非常有用的。

二、DNA聚合酶

DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA。在基因工程中常用的有以下几种:

(一)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

是由一条多肽链组成,分子量为109kD,具有三种活性,即5'-3’DNA聚合酶活性,5'-3’及3'-5’外切核酸酶活性,同时它还具有RNA酶H的活性。RNA酶H的活性是大肠杆菌细胞存在所必需的,但在分子克隆中未用到此活性。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ在分子生物学实验中常用于:1.缺口平移制作标记DNA探针;2.合成cDNA的第二链;3.填补双链DNA的3’凹端。

(二)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow片段)

大肠杆菌DNA聚合酶I用枯草杆菌素(subtilin)处理后,可以产生大小不同的两个片段。其中大片段称为Klenow片段(由Klenow等人于1970年报道)。该片段仅具有5'-3’DNA聚合酶活性及3'-5’外切核酸酶活性。Klenow片段在分子生物学实验中常用于:1.补平限制酶切割DNA产生的5’突出的粘性末端;2.对5’突出的粘性末端进行末端标记;3.合成cDNA的第二链。

(三)T7噬菌体DNA聚合酶

T7噬菌体感染大肠杆菌诱生的DNA聚合酶是两种紧密结合的蛋白质的复合体,这两种蛋白质一个是T7噬菌体基因蛋白,另一个是宿主菌的硫氧环蛋白。这个复合物是所有已知DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个。T7噬菌体DNA聚合酶所催化合成的DNA的平均长度比其他DNA聚合酶催化合成的DNA的平均长度大很多,在DNA序列测定时具有很大的优势。T7噬菌体DNA聚合酶没有5'-3’外切核酸酶活性,但其3'-5’外切核酸酶活性非常强。通过基因工程手段生产出一种经过改造的T7噬菌体DNA聚合酶,它完全丧失了外切核酸酶的活性,其商品名为测序酶,是目前DNA序列测定中最常用的酶。

(四)Taq DNA聚合酶

是一种耐热的DNA聚合酶,适用于PCR。最佳作用温度为75-80℃。于60℃时聚合酶活性仅剩50%,于37℃时聚合酶活性仅剩10%。在较低温度下开始缓慢聚合反应,可以避免引物从模板上解离。

三、逆转录酶

逆转录酶或称反转录酶(reverse transcriptase)是依赖于RNA的DNA聚合酶,即以RNA为模板合成DNA。但实际上,也可以单链DNA为模板合成DNA。

商品化的反转录酶有两种,一种是从禽成髓细胞瘤病毒(AWV)的病毒颗粒纯化而得到的禽源逆转录酶;另一种是鼠源逆转录酶,是将Moloney鼠白血病病毒(MMLV,或Mo-MLV)的逆转录酶的基因克隆后,在大肠杆菌中分离得到的。鼠源逆转录酶较为常用。

四、DNA连接酶

DNA连接酶催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键而将DNA片段连接起来。在基因工程中最常用的是T4噬菌体DNA连接酶。

五、核酸酶

常用的核酸酶有S1核酸酶(nuclease S1)。S1核酸酶可降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸,双链DNA及DNA-RNA杂交体对此酶相对不敏感。然而如果所用得酶量非常大,则双链核酸可被完全消化。中等量的S1核酸酶可在切口(nick)或小缺口(small gaps)处切割双链DNA。S1核酸酶可用于去除DNA片段突出的单链尾,以产生平末端,也可用于切开双链cDNA合成中产生的发夹环。

六、末端转移酶(terminal transferase)

参考资料

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