【4.3.7】电泳

电泳是指带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下,向带相反电荷的电极作定向移动的现象。显然,带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。在待分离样品中,各种生物分子的带电性质以及大小、形状等存在的差异使得它们的“泳动”速度不同,因而可以利用电泳技术对它们进行分离、鉴定或纯化。与蛋白质分离纯化有关的电泳技术有:等电聚焦(isoelectric focusing electrophoresis,IFE)电泳、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis)。

1. IFE

IFE需要在凝胶中加入两性电解质,以便在两极之间建立pH梯度,处在其中的蛋白质分子在电场的作用下发生迁移,最后各自移动到并聚焦于凝胶上某一特定的位置,各个位置的pH与聚焦在此的蛋白质的pI相同。通过IFE,不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离,还可以直接测定出各种蛋白质的pI。

2. SDS-PAGE

蛋白质在非变性聚丙烯酰胺凝胶(native PAGE)中电泳时,其迁移率取决于分子的大小、形状及其所带净电荷等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除,并使分子形状趋于一致,那电泳迁移率将只取决于分子的大小。在此基础上,还可以测定出蛋白质的相对分子质量。阴离子去污剂SDS具有这种作用。在向蛋白质溶液中加入足够量的SDS以后,SDS即与蛋白质形成复合物。SDS带负电,能使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其总量大大超过了蛋白质分子原来的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别。SDS还能打破维持蛋白质三级结构的次级键,使各种蛋白质都呈线状展开。这样的蛋白质-SDS复合物,在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响,仅取决于它们的大小,因而SDS-PAGE可以用于测定蛋白质的相对分子质量。 SDS-PAGE不仅可以用来测定蛋白质的大小,还可以用来鉴定蛋白质的纯度、定量蛋白质和二硫键的确定等。

3. 双向电泳

双向电泳也称二维电泳或2D电泳,它由第一向等电聚焦电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳组成,第一向利用等电聚焦的方法使pI不同的蛋白得到分离。将第一向电泳的凝胶转移到SDS-PAGE平板的顶部,即进行第二向电泳,这一次是按照分子大小来分离,两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。在对凝胶进行染色以后,可以观察到各个蛋白质的位置。 使用双向电泳,研究者有可能观测并建立一种特定细胞所表达的全部蛋白质的目录。ExPASy(http://expasy.hcuge.ch/)已建立了双向电泳数据库,数据库内含有多种类型的细胞和组织的蛋白质双向电泳图谱。

参考资料

  • 南京大学 杨荣武老师 《结构生物学》课件
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