【5.1.1.1】电泳(IFE/SDS PAGE/)

电泳是指带电的颗粒或生物分子在外加电场作用下,向带相反电荷的电极作定向移动的现象。显然,带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多少等都会影响它们的电泳速度。在待分离样品中,各种生物分子的带电性质以及大小、形状等存在的差异使得它们的“泳动”速度不同,因而可以利用电泳技术对它们进行分离、鉴定或纯化。与蛋白质分离纯化有关的电泳技术有:等电聚焦(isoelectric focusing electrophoresis,IFE)电泳、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis)。

1. IFE

IFE需要在凝胶中加入两性电解质,以便在两极之间建立pH梯度,处在其中的蛋白质分子在电场的作用下发生迁移,最后各自移动到并聚焦于凝胶上某一特定的位置,各个位置的pH与聚焦在此的蛋白质的pI相同。通过IFE,不仅可以实现pI不同的蛋白质之间的分离,还可以直接测定出各种蛋白质的pI。

2. SDS-PAGE

蛋白质在非变性聚丙烯酰胺凝胶(native PAGE)中电泳时,其迁移率取决于分子的大小、形状及其所带净电荷等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除,并使分子形状趋于一致,那电泳迁移率将只取决于分子的大小。在此基础上,还可以测定出蛋白质的相对分子质量。阴离子去污剂SDS具有这种作用。在向蛋白质溶液中加入足够量的SDS以后,SDS即与蛋白质形成复合物。SDS带负电,能使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷,其总量大大超过了蛋白质分子原来的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别。SDS还能打破维持蛋白质三级结构的次级键,使各种蛋白质都呈线状展开。这样的蛋白质-SDS复合物,在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响,仅取决于它们的大小,因而SDS-PAGE可以用于测定蛋白质的相对分子质量。 SDS-PAGE不仅可以用来测定蛋白质的大小,还可以用来鉴定蛋白质的纯度、定量蛋白质和二硫键的确定等。

蛋白电泳的迁移率与一下三个因素有关:

  1. 形状—所有的蛋白质在用还原剂处理后都处于一级结构中。 因此,形状不影响蛋白质的分离。
  2. 电荷—经过SDS处理后,所有的蛋白质都是负电荷, 因此,电荷不影响分离。
  3. 大小—蛋白质的分离完全与它们的分子量大小有关。

在电泳中,分子量越小的多肽移动得越快,因为它们遇到的阻力更小。分子量越大的多肽移动得更慢,因为它们遇到的阻力更大。因此蛋白质完全是因为分子量大小的不同而分开

SDS主要的作用有:

  1. 去蛋白质电荷
  2. 解离蛋白质之间的氢键
  3. 取消蛋白分子内的疏水作用
  4. 去多肽折叠。所以不能断开二硫键。

DTT:还原剂,可以断开二硫键。有些蛋白天然活性结构是二聚体或三聚体,如果加入β-巯基乙醇,它会还原多聚蛋白之间和内部的二硫键,这样,电泳的样品将会被完全还原成单体形式,不加的样品中则会保持聚体的形式,这时候样品在凝胶中的位置就会处于其2倍或3倍分子量的位置了。

SDS-PAGE有两种:

  • 非还原性(non-reduced)SDS-PAGE
  • 还原性(reduced)SDS-PAGE之分

均是变性条件下的电泳。还原与非还原的区别是在样品处理时加或不加还原剂(如DTT或2-巯基乙醇等)。非变性(non-denaturing)PAGE又称为天然(native)PAGE,操作的基本过程与SDS-PAGE相似,唯一不同的是在实验过程中尽可能保持蛋白质的天然完整性,包括避免使用任何还原剂、缓冲液中避免使用变性剂(如SDS)、样品的预处理以及电泳过程应在低温下进行等。

蛋白的样品处理方法有3种:

  • 还原SDS处理
  • 带有烷基化作用的SDS处理
  • 非还原SDS处理

还原SDS处理:是常规的SDS—PAGE,在上样缓冲液中加入还原剂,DTT等,打开二硫键,SDS打开非共价键,所以使蛋白还原变性为椭圆形单体。

带有烷基化作用的SDS处理:烷基可以永久并且牢固的保护巯基,维持单体形成,防止蛋白再次形成二硫键的空间结构。 

非还原SDS处理:样品中只加入SDS,而不加DTT还原剂,此时二硫键不能断裂,所以蛋白没有完全去折叠。保持这一定的4级结构。非还原SDS处理因为二硫键的连接,可能会有几条多肽链连在一起,所以最后的分子量要比预期的大,可能是2倍或3倍。 

3. 双向电泳

双向电泳也称二维电泳或2D电泳,它由第一向等电聚焦电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳组成,第一向利用等电聚焦的方法使pI不同的蛋白得到分离。将第一向电泳的凝胶转移到SDS-PAGE平板的顶部,即进行第二向电泳,这一次是按照分子大小来分离,两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。在对凝胶进行染色以后,可以观察到各个蛋白质的位置。 使用双向电泳,研究者有可能观测并建立一种特定细胞所表达的全部蛋白质的目录。ExPASy(http://expasy.hcuge.ch/)已建立了双向电泳数据库,数据库内含有多种类型的细胞和组织的蛋白质双向电泳图谱。

参考资料

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