【5.7.2.3】ELISPOT检测ASC

酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) ,作为一项新型的免疫酶技术,是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法敏感性高,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低,已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中。

一、原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子,此细胞因子被特异单克隆抗体捕获,被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合,其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。 BCIP/NBT 底物孵育后, PVDF 孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子,通过ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

从字面上来说,可以分解成两部分:“酶联免疫”与“斑点”。

- ELISA ELISPOT
酶联免疫 抗体捕获的抗原来自样品溶液中的已经存在的、均匀分布的抗原分子 抗体捕获的抗原来自样品细胞在检测的当时新鲜分泌的抗原分子
酶联免疫斑点 显色出来的是或深或浅的有色溶液 显色出来的是沉积在固体基板上或多或少的有色斑点

一言以蔽之,ELISA 检测的是无生命的溶液中抗原分子的浓度,ELISPOT 检测的是有生物活性的活细胞分泌抗原的功能。

二、工作原理

A. 特异性单抗包被在培养孔底部;

B. 加入细胞及刺激物培养,阳性细胞开始分泌细胞因子,细胞因子就近被包被抗体捕获;

C. 移出细胞,板底留下自胞因子的潜在“影像”;

D. 加入酶标记的检测抗体,检测抗体和“影像”上的细胞因子结合,形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构;

E. 加入显色底物,在酶的催化分解下,生成不可溶的色素,就近沉淀在局部的膜上形成斑点;

F. 斑点计数(可人工计数,也可用自动读板仪计数),数据处理,结果分析。

三、ELISPOT的优势

参考资料

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