【4.3.2】蛋白质和核酸的沉淀(Precipitation)

一、蛋白质沉淀(Precipitation of proteins)

凡是能破坏水化膜和(或)能中和表面电荷的物质均会导致溶液中的蛋白质发生沉淀。导致蛋白质发生沉淀的因素有:既破坏水化膜又中和电荷的中性盐;中和电荷的等电点pH;破坏水化膜的有机溶剂;中和电荷的生物碱等。不导致蛋白质变性的沉淀方法经常用于蛋白质的分离、纯化。

(1)盐析。在蛋白质溶液中加入一定量的中性盐,可使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析(salting out)。发生盐析的原因是盐在水中迅速解离后,与蛋白质争夺水分子,破坏了蛋白质颗粒表面的水化膜。另外,离子可大量中和蛋白质表面上的电荷,使蛋白质成为既不含水化膜又不带电荷的颗粒而聚集沉淀。盐析时所需的盐浓度称为盐析浓度,一般用饱和百分比表示。不同蛋白质的分子大小及带电状况各不相同,盐析所需的盐浓度也就不同。因此,可以通过调节盐浓度,使混合液中不同的蛋白质分别沉淀析出,从而达到分离的目的,这种方法称为分段盐析。硫酸铵是盐析中最常用的中性盐[。

有时,在蛋白质溶液中加入的中性盐的浓度较低时,蛋白质溶解度不降反增,这种现象称为盐溶(salting in)。产生盐溶现象的原因是蛋白质颗粒上吸附某种无机盐离子后,蛋白质颗粒带同种电荷而相互排斥,同时与水分子的作用得到加强,从而导致溶解度提高。

(2)pI沉淀((pI precipitation))。当蛋白质溶液处于pI时,蛋白质分子主要以两性离子形式存在,净电荷为零。此时蛋白质分子失去同种电荷的排斥作用,很容易聚集而发生沉淀,这种沉淀蛋白质的方法叫pI沉淀。pI沉淀既可用来分离蛋白质,也可用来粗略测定某种蛋白质的pI。

(3)有机溶剂引起的沉淀(Addition of organic solvent)。某些与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮)可使蛋白质产生沉淀,是因为这些有机溶剂和水的亲和力大,能破坏蛋白质表面的水化膜,从而使蛋白质的溶解度降低。此法也可用于蛋白质的分离、纯化。

(4)重金属盐作用造成的沉淀(Addition of heavy metal salts)。当蛋白质溶液的pH大于其pI时,蛋白质带负电荷,这时如果遇到重金属,会与重金属离子结合形成不溶性的蛋白盐而沉淀。由于重金属的作用通常会蛋白质失活,因此很少用它来纯化蛋白质。

(5)加热(Heating)

二、核酸沉淀(Precipitation of nucleic acids)

水相中的核酸可在一定盐浓度下,使用2.5~3倍体积的冷无水乙醇和少量无机盐进行沉淀。

  1. DNA:加乙醇和盐(DNA: Add ethanol and salt, usually Sodium acetate)
  2. RNA:加异丙醇(RNA: Add isopropyl alcohol)

参考资料

  • 南京大学 杨荣武老师 《结构生物学》课件
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