【5.2.3】蛋白纯化标签

获得高质量、高纯度以及高天然保真性的蛋白是科研中至关重要的第一步,重组蛋白表达技术作为研究蛋白功能、结构以及筛选靶向药物最有力的工具,在基础科学以及医药学等领域中发挥着不可替代的作用。蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系,通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的,目前常用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统。

一、重组蛋白在科研中具有很高的研究应用价值:

  • 作为抗原制备抗体
  • 参与细胞及动物实验
  • 蛋白酶活的测定
  • 蛋白互作研究
  • 蛋白晶体结构解析
  • 免疫组化
  • 药物蛋白的研究

蛋白本身的特性、载体的选择以及融合标签等因素都影响蛋白表达量。其中亲和标签是目前用于重组蛋白表达纯化中最常用的手段。

  • 一方面是因为合适的标签可以促进某些不溶性蛋白可溶;
  • 另一方面可通过带标签的重组融合蛋白选择性的与层析基质上的配体结合,从而纯化任何蛋白。

然而,在蛋白的结构解析研究或体外诊断试剂的应用中,亲和标签会给研究带来潜在干扰,所以往往需要接近天然的无标签蛋白。如何获得无标签蛋白?

  • 一种方法可以通过内含肽对融合蛋白进行自我剪切从而获得天然N 端的重组蛋白,但剪切过程较缓慢,并在很大程度上依赖于内含肽与目的蛋白连接处的氨基酸序列;
  • 另一种方法可以对融合蛋白用蛋白酶进行剪切纯化,再通过亲和层析去除蛋白酶和切除融合标签从而获得天然蛋白,此方法可快速得到蛋白;
  • 也可直接表达不含标签的蛋白,应用离子交换、分子筛、肝素柱、HIC疏水层析等方法纯化,通过AKATA纯化设备获得蛋白。

二、先表达融合蛋白再切除标签,亲和标签及蛋白酶的选择

在蛋白纯化过程中,经常通过添加合适的标签辅助蛋白纯化,促进蛋白可溶性。

2.1 常用的几种蛋白纯化标签比较

  • 6His,蛋白纯化首选标签,分子量小,对蛋白无影响,能纯化可溶性/包涵体蛋白
  • GST,增强蛋白可溶性,仅能纯化可溶性蛋白,屏蔽毒性蛋白,标签较大
  • MBP,增强蛋白可溶性,屏蔽毒性蛋白,标签较大,对蛋白结构/功能会有一定影响
  • Myc,高特异性,在天然洗脱条件下,使用Myc标签多肽来与重组蛋白进行竞争,可温和洗脱Myc标签蛋白质
  • SUMO,增强蛋白可溶性,切割特异性极高,不残留任何氨基酸,适合重组蛋白表达
  • Strep,不会影响标签蛋白的功能结构,更简便,适合高纯度蛋白产出
  • Flag,通常不与目的蛋白相互作用,纯化效率高,应用广泛

His标签的优势与缺点

His标签亲和层析,属于固定化金属亲和层析(IMAC)这个概念内。

已知过渡金属与组氨酸和半胱氨酸间具有亲和作用,IMAC正是以此亲和力为基础。Porath用亚氨基二乙酸(IDA)作为螯合配基,将金属离子固定在琼脂糖上1。

80年代发明了螯合配基次氨基三乙酸(NTA),随后又进一步发展。连续的组氨酸是在DNA模板上对重组蛋白的遗传修饰2。

IDA为三价,NTA四价,TED为五价。其主要差异为,IDA与NTA结合量较高,但IDA在平衡与清洗过程中,比NTA脱落更多的Ni2+离子,并且,多次使用IDA纯化同一蛋白也会有纯度的降低。TED只剩1个配位键与His标签作用,因此蛋白回收率通常较低。

IMAC为最广泛的层析技术12。主要优势在于使用简便,成本低廉,耐用性好;其次His标签可在8M 尿素或6M盐酸胍等变性条件下应用,氧化还原条件下也可以;亲和力高,因此在高蛋白质浓度下也能实现高捕获率;纯化工艺具有可放大性;另外,因为标签较小(通常6个氨基酸),标签不像其他大的标签对蛋白质活性影响那么大,功能研究时,通常不需要切除此标签。

His标签局限性在于:螯合剂需尽可能避免,或只能在浓度应用,虽然有生产厂商开发出高耐受度的层析填料(如Ni Sepharose Excel13)。其他具有螯合作用的基团,如Tris、铵盐以及某些氨基酸(组氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等)也需要避免。另外,His标签作为纯化标签,其对蛋白的可溶性表达影响有限,当需要促溶表达时,往往还需联合MBP、GST、TrxA等标签使用;由于天然蛋白表面也具有和金素离子相互作用的基团,或存在连续组氨酸残基,如人的转录因子TFIIA的α亚基即有暴露于表面的连续7个组氨酸残基,不可避免与IMAC填料结合,因此His标签纯化纯度相对不高。

2.2 标签切除蛋白酶

  • 肠激酶(Enterokinase): Flag-tag C端的5个氨基酸残基DDDDK是肠激酶的识别位点,该酶包含通过切割试剂所具有的大多数特征,活性高、适应pH范围广,在多种变性剂下和清洁剂浓度下均能使用,对其五肽识别位点有高度专一性识别并在识别位点的C端进行切割,留下没有多余氨基酸的切割产物。

  • 凝血酶(Thrombin): 一种广泛用于切割标签的蛋白酶,凝血酶的最佳切割位点是X4-X3-P-P[K]-X1’-X2’,这里的X4和X3是疏水氨基酸,而X1’和X2’是非酸性氨基酸,一些经常识别的位点是L-V-P-R-G-S,L-V-P-R-G-F和M-Y-P-G-N。在X4-X3-P-R-G-X2’之间切割比在X4-X3-P-K-L-X2’效率更高。其他识别位点是X2-R[K]-X1’,这里的X2和X1’是甘氨酸,例如A-R-G和F-K-A,这里切割发生在第二个残基后。

  • TEV protease: 是一种重组表达的半胱氨酸蛋白酶,能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser,并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切。TEV Protease的最佳酶切温度是30℃,在4℃时也保留了一定的活性,为尽可能保留目标蛋白活性,在实际操作中常用4℃过夜酶切。

  • Xa因子: Xa因子是一种较高效的去除融合标签的工具酶,可特异性识别I-E[D]-G-R-X1序列,并将融合标签从其C末端切除。

三、若选择直接表达无标签蛋白,纯化方法尤为重要,目前常用的纯化方法有:

3.1 离子交换层析法(Ion Exchange Chromatography,IEC):

离子交换层析是根据蛋白质所带电荷量差异来进行分离纯化的一种技术。蛋白质表面的电荷取决于可电离氨基酸侧链基团的数量和类型。每个蛋白具有一个等电点,即正电荷和负电荷中和为零时的PH。离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的,可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质,称为阴离子交换剂,如DEAE-纤维素树脂;反之称为阳离子交换剂,如CM-纤维素树脂。当缓冲溶液中的PH低于蛋白的等电点时,此时的蛋白带正电,可与阳离子交换树脂中带负电的官能团结合;反之则可与阴离子交换树脂带电荷的官能团结合。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时,亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱,而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此,通过增加缓冲液的离子强度或改变PH,便可改变蛋白质的吸附状况,使不同亲和力的蛋白质得以分离。

3.2 疏水层析(HydrophobicInteractionChromatography,HIC):

疏水层析也称为疏水作用层析,是利用盐-水体系中样品分子中的疏水基团和固定相的疏水配给之间的疏水力不同进行分离的一种层析方法。根据被分离组分分子表面的疏水微区、变性后暴露出的疏水残基、或在高盐环境中暴露于蛋白表面的疏水残基与与固定相的疏水性配体之间的作用强弱,依次用从高到低的离子强度洗脱液从而将疏水作用由强到弱的组分分离开来。

3.3 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography):

凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)又称排阻层析或分子筛方法,是利用具有某些惰性的立体多孔网状结构、且呈珠状颗粒的凝胶作为固定相,将蛋白质混合物中的物质根据其分子大小的不同从而进行分离的技术。相对分子量较大的蛋白由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的空隙向前移动,速度快的首先流出,流程较短;相对分子量较小的蛋白则可以自由穿梭于任意凝胶颗粒的网孔,流程不定导致移动速度慢,从而最后被分离。中等大小的蛋白分子则介于这两者之间被分离出来。一般来说,凝胶过滤层析柱越细、越长纯化的效果会越好

3.4 肝素柱纯化(Heparin-Sepharose affinity chromatography):

肝素(Heparin)是一种含硫酸酯的酸性多糖,能与多种蛋白分子结合,在重组蛋白的纯化应用中,它能与重组人血管内皮生长因子、重组人内皮抑素及重组人角质细胞生长因子等分子结合,肝素亲和层析介质是以高流速琼脂糖微球为基质,采用环氧活化工艺,将肝素偶联到琼脂糖凝胶上,从而应用于某些蛋白的纯化。

四、蛋白鉴定

最终得到的蛋白需要通过SDS-PAGE,HPLC,WB,蛋白浓度检测,吸收光谱等手段鉴定其质量。

参考资料

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